免疫组织化学

免疫组织化学的基本知识

1免疫组织化学的概念:

免疫组化就是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。

2免疫组化实验所用的抗体有哪些？

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体与多克隆抗体。单克隆抗体就是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

3免疫组化实验所用的组织与细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,细胞标本包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片。其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本的方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

4石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用的修复液就是pH6、0的0、01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

5免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。

6抗体交叉反应的原因:

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面:

1、抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子,必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。

2、共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。

3、决定簇相似,两种不同的抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。

免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述

*免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)

-就是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要就是多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为～。

(一) 对抗原与抗体的要求

*具有特异性高与亲与力强的抗体就是实验成功的首要条件。

-对抗体的要求:纯度高、比活性强;

*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。

-对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。

(二) 抗原 (antigen, Ag)

*抗原的概念:凡就是在机体内引起体液免疫与(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:

-免疫原性:引起机体产生抗体与(或)致敏淋细胞的特性;

-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特

性。

*根据抗原就是否显示免疫原性分为:

-完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的就是蛋白质抗原,多糖次之;脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂与药物等。*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。

载体

*通常就是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗

原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

(三)抗体 (antibody, Ab)

1、抗体的概念:

*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合

的球蛋白,被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内;

-抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体与多克隆抗体。

*单克隆抗体:就是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

-特异性强、抗体产量高。

*多克隆抗体:就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-特异性低,会产生抗体的交叉反应。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。

-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备

*动物的选择

*佐剂(adjuvant)

*免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价的测定

*放血或定期抽血

免疫组化常见问题及解决方法

当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色

①确认就是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有的试剂就是否按正确的顺序加入,就是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认就是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统就是否与一抗匹配,这一点就是非常重要的。比如,如果一抗就是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗来匹配;或一抗就是小鼠的IgM一抗,二抗必须就是山羊/兔抗小鼠的IgM(不就是IgG)二抗。

④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤检查抗体的有效期与保存条件,尤其就是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。

⑥检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。