芦丁清除DPPH自由基微量模型建立

正交表进行实验 （ , - *） 。
表 !$ 因素水平表 因素 . %&&’・浓度 3 %&&’・加入量 % 反应时间 （ !/01 2 (） （ !(） （ /4,） ! !56 !56 *6 # #66 !75 +6 * #56 #66 56 !"#"*$ 验证实验$ 根据正交实验确定的最适实验条 水平
加入量和反应时间进行单因素考察实验， 确定清除 !""#・方 法 的 最 佳 因 素 水 平， 并根据现有实验条 件、 研究经验及研究报道， 对实验波长和光线进行了
# !"
考察。 !"#"#$ 正交实验$ 按 照 单 因 素 实 验 结 果， 选择 %&&’・浓度、 %&&’ ・ 加 入 量 和 反 应 时 间 为 主 要 因
+ 素， 进行正交设计， 各因素水平设置见表 ! ， 按 (（ ) * ）
素考察的最佳水平 %# 。故最佳实验条件为： .* 3 ! %# ， 即 %&&’・的浓度为 #56 !/01 2 (， 加入量为 !56 !(， 反 应 +6/4, 。
!#%" 验证实验
为了更好的把 %&&’・方法应用于实践， 对上述 微量模型中的参数进行验证实验， 以获得模型的稳 定性和准确性， 我们进行了重复实验和标准品对照 实验。稳定性实验 NP% 为 #"L7Q ， 表明结果稳定可 靠。标准品对照实验结果见表 + 。
$%&’()*+%’ %, -+./%? -%(01 ,%/ 2.)30’4+’4 5667 ,/00 /)(+.)1 ,/%- /&*+’
* * *， " !"#$ %&$ ， ， ’("#$ %&$ ， ， )"#$ !*+? ,&$ ，
（ $%@4AB3BCBD 0E FGBC:G1 ":0HCIBA， #D4G4 J43KD:A3BL， MG3ED4N &’())& ， OP34G； *%"PG:/GIDCB3IG1 O011DND 0E #D4G4 J43KD:A3BL， MG3ED4N &’())& ， OP34G） 892*/).*： !"# $%&"$’$()* #+,#%-.#(& /)0 1#0-’(#1 )22$%1-(’ &$ 3（ .& ） $%&"$’$()* &)4*# )5&#% 1#&#%.-(-(’ &"# 0-(’*# 5)2&$% #+,*$%)&-$(% 67 &"# 1-%#2& ? 8-#/-(’ )()*70-0 )(1 8)%-)(2# )()*70-0 $5 &"# %#09*&0 $5 &"# $%&"$’$()* #+,#%-.#(& ， &"# $,&-.9. #+,#%-.#(& 2$(1-&-$(0 /#%# 2$(5-%.#1 &")& &"# 2$(2#(&%)&-$( $5 :;;<・ /)0 *() !.$* = 3， &"# )11-&-$( 8$*9.# $5 :;;<・ /)0 $() !3 )(1 &) .-( /)0 >#,& -( %$$. &#.,#%)&9%#% ?@: $5 &"# #8)*9)&-$( &#0& /)0 *%7’ A ， )(1 -& 0"$/#1 &"# .#&"$1 /)0 0&)4*#% B(1 90-(’ &"# 0&)(1)%1 $5 !%$*$+， ;C， 6<B )(1 6<! )0 2$(&%$* ’%$9,， &"# .$1#* /)0 59%&"#% 2#%&-5-#1 &")& -& /)0 ,%#2-0-$( )(1 5#)0-4-*-&7% !"# %#09*&0 -(1-2)&#1 &")& &"# .-2%$ ? .$1#* 5$% 02)8#(’-(’ :;;< 5%## %)1-2)* 5%$. %9&-( /)0 %),-1 ， )229%)&#， *-&&*# 0).,*#， 0&)4*# )(1 %#*-)4*# 5$% &"# 02%##(-(’ )(&-$+-1)(& )2&-8-&7 $5 ()&9%)* ,%$192&0% :0; <%/(2： %9&-(；.-2%$,*)&#；:;;< 5%## %)1-2)*；)(&-$+-1)(& .$1#* 中图分类号： 96*)$%$+ + + + 文献标识码： >+ + + + 文 章 编 号： $))*?).)Q （ *))- ） )&?))-Q?). + + 目前， 用于评价药用植物抗氧化能力的方法已 法、 硫代巴比妥酸 有很多， 如硫氰酸盐 （ BP30ILG4GBD ） （ 9=> ） 法 和 R5>O （ GCB0/GBDH 0;LND4 :GH3IG1 GSA0:SG4ID IGTGI3BL GAAGL ） 法等。这些方法存在一定 的优势， 但同时操作繁琐、 费时， 所需试剂或大型仪 器的费用昂贵。$ ， $? 二苯基苦基苯肼 （$， $ ? H3TPD4L1 ?* ? T3I:L1PLH:GUL1， !""# ） 是一种稳定的有机自由 基， 通过检测样品对 !""# 自由基的清除能力， 可以 了解其抗氧化性的强弱。目前国内测定清除自由基 能力的方法是分光光度法， 该方法在筛选天然产物 单体时， 样品消耗量大， 操作繁琐费时， 并且该方法 的准确 性、 灵敏度和可行性尚未有文献系统的研
， 验 证 该 模 型 的 稳 定 性； 并以 件， 重复实验 （ , - *） 89010: 为参比， &;、 3’. 和 3’8 为阳性对照， 分别用
［) ］ 微量法和分光光度法 对 89010: 、 &;、 3’.、 3’8 与芦
表 +$ 标准品对照表 I=56 （ !J 2 /(） 标准品 分光光度法 微量法 89010: *"** !*"L# &; 6")) +"!# 3’. #"!5 L"LL 3’8 +"++ !L"75 芦丁 *"6K !*"66 8<.= （ !/01 2 J） 分光光度法 微量法 ! ! !*+!K"!+ !*+65"+5 K#**"#5 K#*6"76 #)++"5+ #)+)"#6 +*6!"!# +#5*"K5
"=#! 实验方法
收稿日期： *))7?)7?$7 作者简介： 王丽 （ $-’- ? ） ， 女， 在 读 硕 士 研 究 生， 主要从事中药药理 研究。 基金项目： 河南省科技厅基础前沿计划 （ )’*.))&()* ） ； 河南省教育厅 基础研究计划 （ *))7>.Q)))* ） 。
［’ ， 7］ $%*%$+ 单因素实验+ 用 -Q 微孔板法 对清除 !""# 自由基的三个主百度文库影响因素： !""# ・浓度、 !""# ・
参考文献：
［ ! ］彭长连， 陈少薇， 林植芳， 等 " 用清除有机自由基 %&&’ 法评价植 物 抗 氧 化 能 力 ［ T］ " 生 物 化 学 与 生 物 物 理 进 展， #666 ， #7 （K） ： K5LUKK#" ［ # ］臧志和， 曹丽萍， 钟铃 " 芦丁药理作用及制剂的研究进展 ［ T］ " 医药导报， #667 ， #K （7） ： 75LU7K6" ［ * ］李娆娆， 原思通， 肖永庆 " 中药槐花化学成分、 药理作用 及炮制研究进展 ［ T］ " 中国中医药信息杂志， #66# （)） ： 77UL#" ［ + ］VC,J TW， ;A0 T， VAC, TO" I, B4>90 C,>40:4DC,> F90F?9>4?S 0X 9A>4, ［ T］ " (Y8， #66L ， +! ： !6K6U!6KK" ［ 5 ］ Z?[CD94 8，\411C,0 %，O?9,C,D?[ R &CE]0, ZW，?> C1" .,>40:4DC,> E0/F0A,DS C,D C,>40:4DC,> CE>4B4>G 4, CE?901C （ !"#$%&’%" ()"*&%+"," %=" ） X9A4>S C,D D?94BC>4B?S ［ T］ " T O00D =0/F0S> .,C1， #66L ， #! ： #L#U#)6" ［ K ］ PA, 8， &0^?9S TN， 8C,J T" (0SS 0X 9A>4, C,D C,>40:4DC,> CE>4B4>G 0X CSFC9CJAS _A4E? ECAS?D ‘G C F?E>01G>4E ?,[G/? F9?FC9C>40, X90/ -.$(*&%##/. +%&(* ［ T ］" O00D =]?/4S>9G ， #667 ，
芦丁清除 !""# 自由基微量模型建立
# # #， " 王! 丽"， ， 张! 丽"， ， 康文艺"， （ $% 河南大学天然药物研究所， 河南开封 &’())& ； *% 河南大学药学院， 河南开封 &’())& ）
& 摘+ 要： 通过单因素考察， 建立 ,（ 正交实验， 对正交实验结果进行直观分析和方差分析， 确定最适实验条件是 - . ）
［$ ］ 究 。芦丁 （ 5CB34 ） 又名芸香苷和紫槲皮苷， 临床应 ［* ， .］ ［& V Q ］ 用广泛 ， 抗氧化活性也多次报道 。本 文 以 芦
丁为研究对象， 通过微孔板法实验， 建立一种微量法 筛选模型。该方法操作快速、 准 确， 用 样 量 小， 且稳 定、 可 靠， 可用于芦丁类似的天然产物批量快速 筛选。
表 #$ 正交实验设计及结果 实验号 ! # * + 5 K 7 L ) M! M# M* N . ! ! ! # # # * * * !#"L# !K"+L !)"*6 K"+L 3 ! # * ! # * ! # * !5"5L !K"K7 !K"*K !"6) 因素 = （ 空白） % ! ! # # * * # * * ! ! # * # ! * # ! !5"KL !K"K+ !K"65 !7"6! !K"LL !+")5 !"#6 #"6K I=56 （ !J 2 /(） !#"!! !*")5 !#"+6 !+"+K !L"67 !K")# #6"!K !L"66 !)"75
!" 结果与分析
!#$" 单因素考察结果
%&&’ ・ 浓 度 #66 !/01 2 (， %&&’ ・ 加 入 量 为 !75 !(， 反应 +6/4, ， 在 +)#,/ 处测定样品的吸光度， 光线对结果没有显著性影响 （ & H 6"5 ） 。
!#!" 正交实验
正交实验结果见表 # 和表 * 。
丁进行 抗 氧 化 活 性 测 定， 结 果 用 89010: 当 量 8<.= （ >9010: ?@A4BC1?,> C,>40:4DC,> ECFCE4>G ） 表示， 验证该模 型的准确性。
$ $ 由表 + 可知， 微量法得到的 I=56 值基本上是分光 光度法的 + 倍多， 但用 89010: 当量表示则基本消除了 因体系 引 起 的 差 异， 对两种方法测得的槲皮素的 8<.= 用 P&PP!*" 软件进行 &C49?DR PC/F1?S 8 8?S>， 结 果相关系数 9 - 6"))7 ， 显著性值 & - 6"6K) ， 表明 # 种 方法之间存在高相关性， 不存在显著性差异； 并且两 种方法测得的抗氧化活性顺序一致， 即 &; H 3’. H NA>4, H 89010: H 3’8。 充 分 说 明 微 量 法 是 准 确 可 行的。
%" 结论
%#$ $ 在参阅国外有关文献的基础上， 首次将正交设
计用于抗氧化模型的建立， 并对模型的稳定性、 准确 性和可行性进行了系统的研究。
%#! $ 本文用芦丁所建立的抗氧化微量模型与分光光
度法相比， 快速、 准确， 用样量小， 且稳定可靠， 适于 天然产物单体化合物， 尤其是芦丁类似物抗氧化活 性的快速筛选。
!""#・的浓度为 *() !/01 2 ,， 加入量为 $() !,， 反应 &)/34。验证实验 56! 为 *%7’8 ， 表明该方法稳定可靠； 标准品 9:010;、 "<、 =#> 和 =#9 对照实验， 表明该模型准确可行。实验结果证明， 用芦丁建立的 !""# ・抗氧化微量筛选模型 快速， 准确， 用样量小， 且稳定可靠， 适合于芦丁类似的天然产物抗氧化活性的快速筛选。 关键词： 芦丁， 微孔板， !""#・， 抗氧化模型
"! 材料与方法
"="! 材料与仪器
!""#・+ 日本东京化成工业株式会社； 没食子 酸丙酯 （ "< ） 、 丁基羟基茴香醚 （ =#> ） 、 二丁基羟基 甲苯 （ =#9 ） + 63N/G ； 9:010;+ >1H:3IP ； 芦丁 + 本研究 所提供， 纯度 -78 ； 甲醇+ 分析纯。 WC1B3AXG4 WM. 酶标仪 + 美国 BPD:/0 Y1DIB:04 公 司； 电子天平+ 梅 特 勒 ? 托 利 多 仪 器 有 限 公 司； O6? #$ 型混合器+ 北京博励阳科技公司； -Q 微孔板， 各种移液器， 枪头等。