苹果酸[精品ppt课件]
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
又称黄原胶，汉生胶，属于酸性胞外 杂多糖，是微生物多糖中产量最大的一种。 1962年美国科学家发现，1964年实现 工业化生产，在美国的生产规模仅次于抗 生素和溶剂，列第三位。
1.黄原胶的结构特征
1975年阐明，黄原胶是由 D—葡萄糖、D—甘 露糖、D—葡萄糖醛酸、乙酰基和丙酮酸组成的 “五糖重复单元”的结构聚合体。
• 发酵液
• 超滤脱盐
灭菌
干燥
干燥
工业粗制品级
工业精制品
• 酶处理
食品级
超滤浓缩
干燥
六、工艺流程
斜面种子 罐发酵 一级种子 提取 离心 二级种子 烘干
磨碎
过筛
产品
方法：包埋法（聚丙烯酰胺凝胶或卡拉胶＋KCl）
该方法易生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此
，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止 这种副反应的发生。
采用固定化技术必须注意以下几个问题：
细胞被固定前富马酸酶活力要高； 使用的固定化方法对酶的损害较小； 细胞被固定后不应引起副反应的发生； 固定化细胞应有高度的操作稳定性。
D-葡萄糖：D-甘露糖：D-葡萄糖醛酸
2 ： 2 ： 1
在水溶液中呈现多聚阴离子，而且 在某些条件下，其分子可发生一级结构 、二级螺旋构象以及超级接合带状螺旋 共聚体构象间的互变现象。
2. 黄原胶的性质
（1）典型的流变特性 （2）低浓度时的高粘性 2%~3%黄原胶→3~7Pa.s的粘度 （3）耐热、耐酸碱性 -98~90℃粘度稳定 130℃ 36min后冷却
到CO2的固定。
2.支路乙醛酸循环。
3.延胡索酸由延胡索酸酶作用转变成苹果酸。
淀粉
葡萄糖
EMP
丙酮酸
固定CO2
草酰乙酸
苹果酸脱氢酶
苹果酸
证据
（1）发酵依赖于CaCO3或其它碳酸盐。 （2）苹果酸对糖的最高转化率可达128％，说明部 分碳源是外源性的（不是从葡萄糖来的）。
CaCO3的双重作用:
（1）提供外源的羧基碳源 （2）调节pH
培养温度33~34℃，通风量0.7m3/（m3.min)， 搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。 当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。
（二）二步发酵法
糖类
根霉
富马酸
酵母菌、细菌
苹果酸
1.菌种 ：华根霉6508
2.斜面培养 葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面 3.摇瓶发酵 a 培养基组成(%) C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10 ，MgSO4 0.05，FeCl3 0.002，CaCO3 5(单独灭菌)。 富马酸发酵 30℃培养4~5d，得到含富马酸和苹果酸的混合液。 30℃培养7d
命的糖量增加，用于合成黄原胶的糖反而减少，
导致黄原胶得率下降。
发酵后期流加糖：使糖浓度始终维持在一
定的水平，补加的糖只用于细胞维持生命及合
成黄原胶，而没有生长的消耗，得率就可比间
歇发酵有较大提高。
起始高浓度氮源：
细胞浓度增加
高浓度氮源 得率降低
合成速率降低
原因：“氧限制”。高浓度细胞随着发酵的进行，发 酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成氧供 应能力逐渐下降，合成速率变慢，得率降低。
技术替代传统的钙盐法；
4.改间歇冷却结晶为连续化真空浓缩降温结晶工艺。
第四节 黄原胶
一、多糖
1.概况
多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成 的大分子化合物。
2. 多糖的分类
（1）根据多糖的来源不同
植物多糖 动物多糖 微生物多糖
（2）根据多糖在微生物体内的分泌部位
胞内多糖 细胞壁多糖 胞外多糖
二、黄单胞菌多糖
（三） 从酶转化液中提取苹果酸
H2SO4 过滤 流程：转化液 → 酸解液 → 12.5%
CaCO3 滤液 → 苹果酸钙
过滤 → 离子交换→ 浓缩→ 结晶→干燥 →苹果酸 H2SO4 65%~80%
八、L一苹果酸生产技术展望
1.选用更合适的原料如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、食用 级淀粉等进行精细发酵； 2.在菌体快速絮凝、发酵液膜分离和净化技术方面 进行探讨； 3.研究用离子色谱法、树脂吸附法、萃取法等提取
酸味剂:
赋予食品酸味为主要目的的食品添加剂。 有机酸类：柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果 酸、草酸； 无机酸类：食用磷酸、碳酸等。
DL-苹果酸：
白色或结晶状粉末，国外采用化学法生产。
L-苹果酸：(L—Malic acid)
无色结晶，存在于植物或其果实中，发酵法或酶
法生产。
二、历史
•20世纪20年代，发现某些霉菌和酵母可积累L-苹果酸。 •60年代，英美用化学合成法生产L-苹果酸，成本高。 •1959年，日本利用短乳杆菌（lactabacillus brevis） 产生的富马酸酶催化富马酸转化为L-苹果酸成功。 •60年代以来，各国争相研制一步法从淀粉等糖质原料 生产苹果酸。
0.5%NaCl可稳定高温下的粘度
（4）相容性及溶解性
与藻酸盐类、淀粉、卡拉胶、瓜胶溶混后 粘度叠加。 易溶于水，不溶于醇、酮等极性溶剂。
（5）分散性及保水性
3. 黄原胶的用途
（1）能源开发 （2）食品工业
（3）其它工业
三、黄原胶的生产
工艺流程：
菌种的扩培→发酵原料配比→发酵→发酵条件控 制→分离→提纯→干燥
六、苹果酸的生产方法
（一）一步发酵法
糖类
曲霉
苹果酸
1.菌种 ：黄曲霉A-114
2.培养基（%） （1）种子培养基（%） C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02， NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(单独灭菌)。
（2）发酵培养基（%） C6H12O6 7%~8% 其余同种子罐培养基 3.发酵 装液量70%，接种量10%，罐压0.1MPa，
b
（三）酶转化法: (常用)
பைடு நூலகம்固定化细胞
富马酸盐（化学合成）
富马酸酶
苹果酸盐
菌种：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）
1.游离细胞酶转化法 8%富马酸溶液（pH7.5）+2%湿菌体→苹果酸
条件：35℃ 150r/min 24~36h 转化率90%以上 2.固定化细胞酶转化法 菌种：产氨短杆菌或黄色短杆菌
（四）两种生产方法的比较：
原料 发酵法
酶转化法
成本 低
高
杂质 低
高
农产品
化工原料
发酵法尚未大规模工业化生产的 主要原因：菌种的产酸率低。
七、苹果酸的提取
（一）从发酵醪液中提取苹果酸
H2SO4 过滤 CaCO3 滤液 苹果酸钙 干燥 苹果酸
流程：发酵液
过滤 H2SO4 离子交换
酸解液
浓缩 结晶 65%~80%
发酵周期为72 h左右，产量最高可达28 g/L
，
氮源对黄胶合成的影响： 易利用有机氮源，不易利用无机氮源。
• 起始较低浓度氮源：
氮源浓度提高→细胞浓度增加→合成速
率加快→得率提高
• 起始中等浓度氮源：
细胞浓度提高 中等浓度氮源 合成速率提高 发酵时间缩短
得率降低
原因：细胞生长过快，用于细胞生长及维持细胞生
（二） 从混杂富马酸发酵醪液中提取苹果酸
反应液中有残余的富马酸盐和多量的苹果酸盐。 提取原理：利用富马酸难溶于水的性质，在反应 液中加酸使富马酸沉淀析出。 发酵醪液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→浓缩
50% 20~30℃ 65%~80%
→析出富马酸结晶→过滤→滤液→冷却加晶种→苹果酸
20℃
结晶→干燥→成品
高粘度发酵液影响供氧，解决方法：
提高搅拌转速
a.改进发酵设备，提高供氧能力
提高通气速率 b.限制细胞浓度，控制氧的需求量——补料分批 培养（后期流加糖）。
四、黄原胶的提取
1.发酵液处理 经离心法、过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化 法、过滤及超滤浓缩法预处理除去菌体细胞和各种不
溶性杂质。
2.沉淀反应
CaCO3对发酵有明显的促进作用。
还有Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素。
（4）其他：促进剂谷氨酸、柠檬酸等。
南开-01菌种所用摇瓶发酵培养基： 玉米淀粉4%，鱼粉蛋白胨0.5%， 轻质碳酸钙0.3%，自来水配制，pH7.0。
3. 培养条件
（1）摇瓶发酵
接种量1%~5% 转速220r/min 28℃ 72h
1. 一步发酵法：黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉；
2. 两步发酵法：华根霉、无根根霉、短乳杆菌、 膜毕赤酵母； 3.酶转化法：短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、 黄色短杆菌。
五、苹果酸合成途径
L一苹果酸在生物体内的合成途径有3条: 1.丙酮酸羧化合成。丙酮酸羧化支路生成草酰乙
酸，由苹果酸脱氢酶作用转变成苹果酸，此涉及
产胶20~30g/L，碳源转化率60%~70%。
（2）工业化生产 温度：2528℃
pH: 6.57.0
高通气量： 1~0.6m3/（m3min)
高碳氮比
周期：7296h
前18 h：对数生长期，不合成胞外多糖；
18～48 h：平衡生长期，多糖合成迅速，菌体
出现荚膜并且越来越厚；
48 h：菌体进入衰老期，多糖产量趋于稳定。
1.菌种
引起甘蓝黑腐病的病原细菌——野油菜黄单胞
菌（Xanthomonas campestris）。
杆状，G－，产荚膜，好氧。
平板：黄色粘稠菌落，液体培养形成粘稠状胶状物。
其他黄单胞菌：菜豆黄单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝
卜黄单胞菌等。
2.培养基
（1）碳源：葡萄糖(国外),淀粉(国内)。 （2）氮源：易利用有机氮（鱼粉和豆粉）， 不易利用无机氮。 （3）无机盐：K2HPO4、MgSO4.7H2O、轻质
•目前，世界上苹果酸的主要产地是日本。
三、生产方法
1. 从果汁中直接抽提法：经济上不合理 2. 化学合成法：产物是DL-苹果酸 3. 发酵法：
（1）一步法 （2）二步法 糖类
根霉
糖类
曲霉
苹果酸
富马酸
酵母菌、细菌
苹果酸
4.酶转化法: (常用)
富马酸盐（化学合成）
固定化细胞 富马酸酶
苹果酸盐
四、常用菌种
黄原胶＋CaCl2
酸化
黄原胶钙沉淀
黄原胶＋Ca2+
↓
成品←粉碎←干燥←洗涤（酒精+KOH）
特点：
有机溶剂用量减少一半，但在成品中带入了钙离子。
五、黄原胶的干燥
1.主要干燥方法 真空干燥 滚筒干燥：设备复杂，工业应用少 喷雾干燥：黄原胶溶解性差 流化床干燥：传热传质快，常用该法。 气流干燥
2.不同级别黄原胶的制备
用钙盐、铝盐、季铵盐或酸沉淀法制取工业级精制 品；用有机溶剂沉淀法制取食品级精制品。
（1）钙盐法
（2）有机溶剂沉淀法
发酵液＋乙醇→ 黄原胶沉淀（工业级黄原胶） 酸化 ↓ （酒精+KOH）洗涤→干燥→粉碎 →成品 离心除菌体，多次用酒精沉淀、洗涤，得食品级黄原 胶。
（3）钙盐－工业酒精沉淀法
酸性乙醇
1.黄原胶的结构特征
1975年阐明，黄原胶是由 D—葡萄糖、D—甘 露糖、D—葡萄糖醛酸、乙酰基和丙酮酸组成的 “五糖重复单元”的结构聚合体。
• 发酵液
• 超滤脱盐
灭菌
干燥
干燥
工业粗制品级
工业精制品
• 酶处理
食品级
超滤浓缩
干燥
六、工艺流程
斜面种子 罐发酵 一级种子 提取 离心 二级种子 烘干
磨碎
过筛
产品
方法：包埋法（聚丙烯酰胺凝胶或卡拉胶＋KCl）
该方法易生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此
，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止 这种副反应的发生。
采用固定化技术必须注意以下几个问题：
细胞被固定前富马酸酶活力要高； 使用的固定化方法对酶的损害较小； 细胞被固定后不应引起副反应的发生； 固定化细胞应有高度的操作稳定性。
D-葡萄糖：D-甘露糖：D-葡萄糖醛酸
2 ： 2 ： 1
在水溶液中呈现多聚阴离子，而且 在某些条件下，其分子可发生一级结构 、二级螺旋构象以及超级接合带状螺旋 共聚体构象间的互变现象。
2. 黄原胶的性质
（1）典型的流变特性 （2）低浓度时的高粘性 2%~3%黄原胶→3~7Pa.s的粘度 （3）耐热、耐酸碱性 -98~90℃粘度稳定 130℃ 36min后冷却
到CO2的固定。
2.支路乙醛酸循环。
3.延胡索酸由延胡索酸酶作用转变成苹果酸。
淀粉
葡萄糖
EMP
丙酮酸
固定CO2
草酰乙酸
苹果酸脱氢酶
苹果酸
证据
（1）发酵依赖于CaCO3或其它碳酸盐。 （2）苹果酸对糖的最高转化率可达128％，说明部 分碳源是外源性的（不是从葡萄糖来的）。
CaCO3的双重作用:
（1）提供外源的羧基碳源 （2）调节pH
培养温度33~34℃，通风量0.7m3/（m3.min)， 搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。 当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。
（二）二步发酵法
糖类
根霉
富马酸
酵母菌、细菌
苹果酸
1.菌种 ：华根霉6508
2.斜面培养 葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面 3.摇瓶发酵 a 培养基组成(%) C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10 ，MgSO4 0.05，FeCl3 0.002，CaCO3 5(单独灭菌)。 富马酸发酵 30℃培养4~5d，得到含富马酸和苹果酸的混合液。 30℃培养7d
命的糖量增加，用于合成黄原胶的糖反而减少，
导致黄原胶得率下降。
发酵后期流加糖：使糖浓度始终维持在一
定的水平，补加的糖只用于细胞维持生命及合
成黄原胶，而没有生长的消耗，得率就可比间
歇发酵有较大提高。
起始高浓度氮源：
细胞浓度增加
高浓度氮源 得率降低
合成速率降低
原因：“氧限制”。高浓度细胞随着发酵的进行，发 酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成氧供 应能力逐渐下降，合成速率变慢，得率降低。
技术替代传统的钙盐法；
4.改间歇冷却结晶为连续化真空浓缩降温结晶工艺。
第四节 黄原胶
一、多糖
1.概况
多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成 的大分子化合物。
2. 多糖的分类
（1）根据多糖的来源不同
植物多糖 动物多糖 微生物多糖
（2）根据多糖在微生物体内的分泌部位
胞内多糖 细胞壁多糖 胞外多糖
二、黄单胞菌多糖
（三） 从酶转化液中提取苹果酸
H2SO4 过滤 流程：转化液 → 酸解液 → 12.5%
CaCO3 滤液 → 苹果酸钙
过滤 → 离子交换→ 浓缩→ 结晶→干燥 →苹果酸 H2SO4 65%~80%
八、L一苹果酸生产技术展望
1.选用更合适的原料如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、食用 级淀粉等进行精细发酵； 2.在菌体快速絮凝、发酵液膜分离和净化技术方面 进行探讨； 3.研究用离子色谱法、树脂吸附法、萃取法等提取
酸味剂:
赋予食品酸味为主要目的的食品添加剂。 有机酸类：柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果 酸、草酸； 无机酸类：食用磷酸、碳酸等。
DL-苹果酸：
白色或结晶状粉末，国外采用化学法生产。
L-苹果酸：(L—Malic acid)
无色结晶，存在于植物或其果实中，发酵法或酶
法生产。
二、历史
•20世纪20年代，发现某些霉菌和酵母可积累L-苹果酸。 •60年代，英美用化学合成法生产L-苹果酸，成本高。 •1959年，日本利用短乳杆菌（lactabacillus brevis） 产生的富马酸酶催化富马酸转化为L-苹果酸成功。 •60年代以来，各国争相研制一步法从淀粉等糖质原料 生产苹果酸。
0.5%NaCl可稳定高温下的粘度
（4）相容性及溶解性
与藻酸盐类、淀粉、卡拉胶、瓜胶溶混后 粘度叠加。 易溶于水，不溶于醇、酮等极性溶剂。
（5）分散性及保水性
3. 黄原胶的用途
（1）能源开发 （2）食品工业
（3）其它工业
三、黄原胶的生产
工艺流程：
菌种的扩培→发酵原料配比→发酵→发酵条件控 制→分离→提纯→干燥
六、苹果酸的生产方法
（一）一步发酵法
糖类
曲霉
苹果酸
1.菌种 ：黄曲霉A-114
2.培养基（%） （1）种子培养基（%） C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02， NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(单独灭菌)。
（2）发酵培养基（%） C6H12O6 7%~8% 其余同种子罐培养基 3.发酵 装液量70%，接种量10%，罐压0.1MPa，
b
（三）酶转化法: (常用)
பைடு நூலகம்固定化细胞
富马酸盐（化学合成）
富马酸酶
苹果酸盐
菌种：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）
1.游离细胞酶转化法 8%富马酸溶液（pH7.5）+2%湿菌体→苹果酸
条件：35℃ 150r/min 24~36h 转化率90%以上 2.固定化细胞酶转化法 菌种：产氨短杆菌或黄色短杆菌
（四）两种生产方法的比较：
原料 发酵法
酶转化法
成本 低
高
杂质 低
高
农产品
化工原料
发酵法尚未大规模工业化生产的 主要原因：菌种的产酸率低。
七、苹果酸的提取
（一）从发酵醪液中提取苹果酸
H2SO4 过滤 CaCO3 滤液 苹果酸钙 干燥 苹果酸
流程：发酵液
过滤 H2SO4 离子交换
酸解液
浓缩 结晶 65%~80%
发酵周期为72 h左右，产量最高可达28 g/L
，
氮源对黄胶合成的影响： 易利用有机氮源，不易利用无机氮源。
• 起始较低浓度氮源：
氮源浓度提高→细胞浓度增加→合成速
率加快→得率提高
• 起始中等浓度氮源：
细胞浓度提高 中等浓度氮源 合成速率提高 发酵时间缩短
得率降低
原因：细胞生长过快，用于细胞生长及维持细胞生
（二） 从混杂富马酸发酵醪液中提取苹果酸
反应液中有残余的富马酸盐和多量的苹果酸盐。 提取原理：利用富马酸难溶于水的性质，在反应 液中加酸使富马酸沉淀析出。 发酵醪液→浓缩→析出富马酸结晶→过滤→滤液→浓缩
50% 20~30℃ 65%~80%
→析出富马酸结晶→过滤→滤液→冷却加晶种→苹果酸
20℃
结晶→干燥→成品
高粘度发酵液影响供氧，解决方法：
提高搅拌转速
a.改进发酵设备，提高供氧能力
提高通气速率 b.限制细胞浓度，控制氧的需求量——补料分批 培养（后期流加糖）。
四、黄原胶的提取
1.发酵液处理 经离心法、过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化 法、过滤及超滤浓缩法预处理除去菌体细胞和各种不
溶性杂质。
2.沉淀反应
CaCO3对发酵有明显的促进作用。
还有Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素。
（4）其他：促进剂谷氨酸、柠檬酸等。
南开-01菌种所用摇瓶发酵培养基： 玉米淀粉4%，鱼粉蛋白胨0.5%， 轻质碳酸钙0.3%，自来水配制，pH7.0。
3. 培养条件
（1）摇瓶发酵
接种量1%~5% 转速220r/min 28℃ 72h
1. 一步发酵法：黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉；
2. 两步发酵法：华根霉、无根根霉、短乳杆菌、 膜毕赤酵母； 3.酶转化法：短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、 黄色短杆菌。
五、苹果酸合成途径
L一苹果酸在生物体内的合成途径有3条: 1.丙酮酸羧化合成。丙酮酸羧化支路生成草酰乙
酸，由苹果酸脱氢酶作用转变成苹果酸，此涉及
产胶20~30g/L，碳源转化率60%~70%。
（2）工业化生产 温度：2528℃
pH: 6.57.0
高通气量： 1~0.6m3/（m3min)
高碳氮比
周期：7296h
前18 h：对数生长期，不合成胞外多糖；
18～48 h：平衡生长期，多糖合成迅速，菌体
出现荚膜并且越来越厚；
48 h：菌体进入衰老期，多糖产量趋于稳定。
1.菌种
引起甘蓝黑腐病的病原细菌——野油菜黄单胞
菌（Xanthomonas campestris）。
杆状，G－，产荚膜，好氧。
平板：黄色粘稠菌落，液体培养形成粘稠状胶状物。
其他黄单胞菌：菜豆黄单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝
卜黄单胞菌等。
2.培养基
（1）碳源：葡萄糖(国外),淀粉(国内)。 （2）氮源：易利用有机氮（鱼粉和豆粉）， 不易利用无机氮。 （3）无机盐：K2HPO4、MgSO4.7H2O、轻质
•目前，世界上苹果酸的主要产地是日本。
三、生产方法
1. 从果汁中直接抽提法：经济上不合理 2. 化学合成法：产物是DL-苹果酸 3. 发酵法：
（1）一步法 （2）二步法 糖类
根霉
糖类
曲霉
苹果酸
富马酸
酵母菌、细菌
苹果酸
4.酶转化法: (常用)
富马酸盐（化学合成）
固定化细胞 富马酸酶
苹果酸盐
四、常用菌种
黄原胶＋CaCl2
酸化
黄原胶钙沉淀
黄原胶＋Ca2+
↓
成品←粉碎←干燥←洗涤（酒精+KOH）
特点：
有机溶剂用量减少一半，但在成品中带入了钙离子。
五、黄原胶的干燥
1.主要干燥方法 真空干燥 滚筒干燥：设备复杂，工业应用少 喷雾干燥：黄原胶溶解性差 流化床干燥：传热传质快，常用该法。 气流干燥
2.不同级别黄原胶的制备
用钙盐、铝盐、季铵盐或酸沉淀法制取工业级精制 品；用有机溶剂沉淀法制取食品级精制品。
（1）钙盐法
（2）有机溶剂沉淀法
发酵液＋乙醇→ 黄原胶沉淀（工业级黄原胶） 酸化 ↓ （酒精+KOH）洗涤→干燥→粉碎 →成品 离心除菌体，多次用酒精沉淀、洗涤，得食品级黄原 胶。
（3）钙盐－工业酒精沉淀法
酸性乙醇