光学显微镜基础知识

5 调节：
相差观察方式
柯勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路（物镜－聚光镜相衬环型号匹配） 对样品聚焦 取下目镜，装上CT望远镜， 调节CT焦距看到清晰的相差环 调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合
荧 光 观 察 方 法
•
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非 温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发 射出的长波光。 • 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光
场曲
ＡＣＨ ＰＬ
色 差
色差校正
对照 基础知识
色差校对
无校对 校对
光学显微镜基础知识
• 显微镜的光学原理 • 像差
• 显微镜的技术参数
• 显微镜的光学部件
基础知识
显微镜的技术参数
• • • • • • • 数值孔径 分辨率 工作距离 焦深 放大倍率 同焦距 同轴度
基础知识
数值孔径(N.A)
基础知识
无盖片物镜
基础知识
物镜光阑的运用
——荧光观察中应用
光阑全开启
光阑适当关小
目
镜
基础知识
目镜的视场
F.N.22
基础知识
标本的视场直径
标本的视场直径 = 目镜视场数 / 物镜倍率
例: WH10X目镜视场数为22 物镜为UPLFL40X 视场直径 = 22 ÷ 40 = 0.55mm
基础知识
奥林巴斯生物显微镜
光学显微镜基础知识 • 显微镜的光学原理
• 象差 • 显微镜的技术参数 • 显微镜的光学部件
基础知识
显微镜成像
F’ F
物镜
显微镜成像
F’ F
物镜
显微镜成像
250mm ＝明视距离
F
F’
物镜 目镜
光学显微镜基础知识
• 显微镜的光学原理
• 像差
• 显微镜的技术参数 • 显微镜的光学部件
轴向色差 侧向色差
ACH
物镜的色差校正 消色差 Ach 半复消色差Fluorite 复消色差Apo 超级复消色差Super Apo – – – – 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 兰和红 + (绿, 紫色(437nm)) 437-657nm 430-1000nm
轴向色差 侧向色差
ACH FL
Competition comparison
OLYMPUS UIS Nikon CFI60 ZEISS ICS Leica DHC
ｆ（TL） 180 200 160 200
物镜校正 Ｆ Ｆ Ｔｃ Ｔｃ
齐焦距离 45 60 45 45
F : Fully Primary Correction in objective & tube lens Tc : Tube-lens Compensation
基础知识
分辨率
ΔR = k λ/NA
Λ：波长 NA：数值孔径 K常数: K光镜 = 0.61；KFV = 0.51
基础知识
数值孔径大分辨率高
基础知识
NA与焦深
基础知识
工作距离(W.D)
基础知识
工作距离
不需要盖玻片 有盖玻片
同焦距（齐焦距离)
基础知识
同轴度
转换到40倍是仍然几乎是中心 比如10倍物镜下的中心
激发 分色 吸收
滤色镜的特性
带宽对图象的影响
SWB: BP420-480
FITC+PI
WB: BP450-480
WIB: BP460-490
NB: BP470-490
双重染色标本的单色和双色观 察
WU WIB DUAL BAND
DAPI+FITC
WIBA
WIG
WIB
FITC+PI
单色滤色镜的特性曲线
分光 滤色镜 T%
• 激发滤色镜:
激发波长选择
nm BAND PASS
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
• 分色镜:
反射激发光,荧光透过
T%
＜A 反射 ＞A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
荧光透过,阻挡杂光
＜B 阻挡
＞B 透过
A
B
nm
滤色镜的选择
荧光素的特性
ÓÓÓ DAPI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine O range Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide ¤· Ó ÓÓ ¨Ó ¤ · ¢ É ä ² ¨³ ¤ 372 350 365 490 490 470 552 541 530 456 450 465 520 590 550 565 572 615
落射式 • 吸收滤色镜 • 分光镜 • 激发滤色镜
• 汞灯光源
落射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
落射荧光显微镜的构造
荧光显微镜光源
• 汞灯光源:
提供激发光(U、V、B、G)
• 氙灯光源：
高峰值更宽，更稳定
荧光显微镜激发透镜组
发射光
• 激发透镜组
吸收 滤色镜 激发 滤色镜
（激发块）:
入射光
重影
平行光线
结像透镜
UIS 系统
Universal Infinity System
————万能无限远系统Fra Baidu bibliotek
1. 完美结合分辨率和对比度
-明场高分辨率 -高对比度、高亮度图像 -清晰的 DIC图像 -更敏感的偏光观察 -清晰、色彩明亮的相衬
UIS 系统
Universal Infinity System
基础知识
像差
理想成像
标本 点 投影图像 点
平面
平面 准确
图形
相似 图形
像差
实际图形
标本
点
投影图像
虚的圆
平面
弯曲的面
图形
变形的图 形
象差的种类
• • • • • • 球差 象散 慧差 畸变 场曲 色差
基础知识
象 差
球差
场曲
象散
负畸变
慧差 正畸变 基础知识
场 曲
ACH
PLAN ACH
基础知识 基础知识
奥林巴斯显微镜无限远光学系统—— UIS
1 2 3 增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变 中间附件设计更简单，不需增加透镜 物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿
4 更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正）
5 接视频效果更好，不需增加照相目镜
1 原理
相差观察方式
利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用 干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差
基础知识
柯勒照明和临界照明
基础知识
临界照明
柯勒照明
基础知识
厚标本和薄标本
4 - 5 um 2um
基础知识
光学显微镜基础知识
• 显微镜的光学原理 • 像差 • 显微镜的技术参数
• 显微镜的光学部件
基础知识
显微镜的主要光学部件
• 物镜 • 目镜 • 聚光镜
基础知识
物
镜
基础知识
物镜的种类
按色差和场曲校正程度分:
2. 系统灵活性
- 无限远校正光学系统 - 物镜和结像透镜完全校正
3. 物镜万能性更强
-A single universal objective lens performs very well in Fluorescence, Nomarski DIC, Phase contrast, Polarized light and, of course, Brightfield -High UV transmission, Strain-free, Perfect correction of Chromatic aberration and other optical aberrations
聚光镜
显微镜的调节
• • • • • 瞳距调节 屈光度调节 光路转换 聚光镜中心 孔径光栏设置
瞳距调节
屈光度调节
调节
100% 20%
80%
100%
光 路 转 换
聚光镜中心调节
②10X物镜 ① 标本
③ 孔径光阑
⑤ 光轴中心调节螺钉
④ 聚光镜升降旋钮 ③ 视场光阑
孔径光栏调节
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
共轭面：吸收光线，直射光通过 补偿面：相位推迟，衍射光通过
物镜 相板
聚光镜环状光阑
相差观察方式
2 特点
鉴定活体细胞最实用、最经济的方法
3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(2~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦
荧光效果不如明场物镜
相差观察方式
4 应用： 无色透明活体标本的细微结构，检查, 鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)
物镜的色差校正 消色差 Ach 半复消色差Fluorite 复消色差Apo 超级复消色差Super Apo – – – – 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 兰和红 + (绿, 紫色(437nm)) 437-657nm 430-1000nm
轴向色差 侧向色差
ACH FL
IR IR
Apo
物镜的色差校正 消色差 Ach 半复消色差Fluorite 复消色差Apo 超级复消色差 Super Apo – – – – 蓝 (486nm) 和红 (657nm)；绿球差 兰和红 + (绿, 紫色(437nm))；绿、兰球差 437-657nm ，绿、兰、深兰球差 430-1000nm
现行显微镜特点和各种滤色镜
油 镜 应 使 用 荧 光 油
物镜光栏的运用
减少杂散光干扰
光栏全开启
光栏适当关小
汞灯灯箱构造
灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮
HR LC
100%
70%
MR MC
30%
HC LR
孔 径 光 栏 开 度 与 图 象
孔径光栏的运用
孔径光栏的运用
对比度调节
奥林巴斯显微镜无限远光学系统—— UIS
显微镜无限远光学系统——UIS
光学系统
有限远
无限远 UIS
Merit of the Infinity system
物镜 D/M
荧光显微镜的优点和用途
优点：
• 检出能力高（放大作用） • 对细胞的刺激小（可以活体染色） • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察——荧光素 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体 荧光等 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
荧光显微镜的主要部件
透射式 • • • • 吸收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯光源
荧光显微镜的作用原理
宽谱线发射光 （汞灯）
滤掉其他光，透过 激发光
激发滤 色片 吸收滤 色片
滤掉激发光，透过 荧光
标本受激发产生 荧光向四周发散
激发光受反射、折射 或衍射向四周发散
荧光的性质
• • • • • 吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓 度、荧光效率
轴向色差 侧向色差
ACH FL
IR IR
Apo
S Apo
消色差物镜
半复消色差物镜
复消色差物镜
基础知识
传统物镜的符号
基础知识
新物镜的符号
基础知识
浮雕相称物镜
其它物镜
相称物镜
超低倍物镜 无应力偏光物镜
基础知识
带校正环物镜
基础知识
对载波片和盖玻片厚度的要求
载玻片: 0.9 - 1.4 mm 盖玻片: 0.17 mm
• 消色差物镜（Ach) • 平场消色差物镜(PlanAch) • 平场半复消色差物镜(Plan-FL或PLFL） • 平场复消色差物镜（PlanApo) • 平场超级复消色差物镜（PlanSApo)
基础知识
UPLSAPO物镜
VIS
信
噪
－ NIR范围内优异的色差校正
物镜的色差校正 消色差 Ach 半复消色差Fluorite 复消色差Apo 超级复消色差Super Apo – – – – 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 兰和红 + (绿, 紫色(437nm)) 437-657nm 430-1000nm