酸奶中细菌的染色鉴定

酸奶中细菌的染色鉴定

一、实验目的

酸奶中有乳酸菌，如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等都是乳酸菌。在实验室中可以用“稀释涂布平板法”“平板划线法”来培养细菌。通常培养后通过观察细菌的菌落可以辨别是哪种细菌，也可以在培养基中加入特定的染色试剂使特定的细菌染色来观察。

不管是何种酸奶，其共同的特点都是含有乳酸菌。这些乳酸菌在人体的肠道内繁殖时会分泌对人体健康有益的物质，因此酸奶对人体有较多的好处：

①是能将牛奶中的乳糖和蛋白质分解，使人体更易消化和吸收；

②是酸奶有促进胃液分泌、提高食欲、加强消化的功效；

③是乳酸菌能减少某些致癌物质的产生，因而有防癌作用；

④是能抑制肠道内腐败菌的繁殖，并减弱腐败菌在肠道内产生的毒素；

⑤是有降低胆固醇的作用，特别适宜高血脂的人饮用。

乳酸菌还可以做细胞分子结构的研究。例如比较细菌和真菌结构区别时就可以使用乳酸菌来研究。

二、实验原理

平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而形成多个相互独立的单菌落。通常认为这种单菌落便为某种微生物的“纯种”。

MRS培养基是经特殊设计，专门用于乳酸菌培养、富集、分离纯化的培养基。本实验采用划线分离法，在MRS培养基上划线稀释不同品牌的酸奶原液，以期分得乳酸菌纯种。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水而使网孔缩小，再加上其细胞壁不含类脂成分，乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合

物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂时，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后，菌体细胞壁呈无色，再经番红等红色染料复染，便能使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验器材

原料：酸奶；

革兰氏染色：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红；

镜检：香柏油；

MRS培养基：

蛋白胨10.0 g

牛肉膏10.0 g

酵母膏 5.0 g

柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g

吐温80 1.0 ml

乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g

磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g

硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g

琼脂18.0 g

蒸馏水1000 ml

pH 6.2~6.6 备注：

1.K2HPO4、MgSO4.7H2O、MnSO4.H2O分开配制，混匀后合并，避免产生沉淀；

2.配制完成后，用NaOH和HCl调培养基pH至6.2~6.4；

3.CaCO3在培养基pH调至恰当值后加入。

器材：油镜、恒温培养箱、超净灭菌台、高温蒸汽灭菌锅、振荡器、接种环、移液枪、酒精灯。

四、实验步骤

4.1 培养基配制：据实验材料章节所列成分配制MRS培养基200ml，调pH至6.2~6.4，高温蒸汽灭菌（灭菌条件：121℃，30min），而后分装至6个无菌培养皿（制成固体培养基）。

4.2 划线分离：取10g酸奶，稀释至100ml，置于摇床上摇动20分钟，取上清液即为10-1稀释液，再取1ml10-1稀释液加入9ml无菌水中制成10-2稀释液，以此类推制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。

4.3 涂平板培养：分别取200μl稀释液涂于培养基表面。密封置于37°C培养箱培养24~48小时。

4.4 革兰氏染色：在无菌条件下，取一块洁净的载玻片，滴3滴无菌水；用接种环从各个培养基上挑取少量菌落，置于事先滴于载玻片上的无菌水中；用酒精灯加热载玻片上滴有无菌水的部位，使无菌水蒸发；在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，使菌落固定在载玻片上；待载玻片冷却后，在固定有菌落的位置滴加1~2滴结晶紫染料，初染1min，而后水洗至无色；在相同位置滴加1~2滴，媒染1min，而后水洗至无色；斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，并充分水洗，去除残留乙醇，终止脱色反应；在相同位置滴加1~2滴番红染料，复染1min，而后水洗至无色，自然风干，镜检。

五、实验结果

六、结果分析

实验证明酸奶中主演含有乳酸菌，且最适宜乳酸菌生长的培养基浓度为

七、参考文献

[1]温建新，刘强，朱霞．不同品牌酸奶活性乳酸菌的检测．试验研究．2009，5(148)：5-7

[2]张幼芽，黄运红，龙中儿．发酵型酸奶中乳酸菌的性能比较研究．食品科学．2007，28(9)：392-394

[3]旭日花．通辽市牧区乳制品中乳酸菌的分离鉴定及发酵特性和保藏性的研究．内蒙古农业大学．2006，1(06)：2-49

[4]张秀丽，张杰，廖兴广等．活性乳酸菌制品中乳酸菌计数条件的优化研究．海峡预防医学杂志．2004，10(4)：12-14

八、鸣谢

感谢实验过程中老师的亲切指导。