核酸分子杂交技术简介及其应用

班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470
核酸分子杂交技术简介及其应用
摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。

探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。

关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望
1 基本概念及原理
核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。

也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。

由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。

DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。

在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。

加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。

变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。

在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。

T m值得大小取决于核酸分子的
G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。

因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。

变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。

根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。

杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。

2 核酸分子杂交类型
核酸的分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交。

液相杂交是将待测的核酸样品和同位素标记的DNA探针同时溶于杂交液中进行反应,然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针,用仪器检测并通过计算机分析杂交结果。

固相杂交技术是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上,目前使用最多的是硝酸纤维素膜。

它对单链DNA有较强的吸附作用,无需特殊的化学处理也能牢固地结合DNA。

RNA经过一些特殊变性剂处理后也能比较容易地结合到硝酸纤维素膜上。

DNA或RNA结合到硝酸纤维素膜上后,就可与溶液中标记探针进行杂交。

固相杂交技术与电泳技术和放射自显影技术结合可以获得清晰的杂交图谱,对定性或定量分析待测核酸样品中特异序列片段非常方便,比液相杂交应用更为广泛。

是目前分子生物学中常用的核酸分子杂交技术[2]。

在固相杂交技术中,对不同的核酸样品、不同的凝胶、核酸的转移和固相支持物的结合方法是不同的，但杂交和放射自显影技术签本基相似的根据被测核酸的来源及处理方法,分子杂交技术可分为斑点杂交、原位杂交、Southern杂交和Northern杂交。

2.1 斑点杂交
又叫打点杂交。

先将待测核酸（变性DNA或RNA）样品（实际工作中是主要是病毒样品），直接点在硝酸纤维素膜上，经烤干固定后，与同位素或生物素标记的探针进行固相杂交，杂交后放射性双链DNA可使X光胶片感光，形成自显影斑点。

斑点杂交的主要特点是事先不用限制性内切酶或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便、灵敏度高，一个点样品中只含0.25-1pg的DNA也能检测到。

但此法的不足是无法知道杂交片段的大小（即碱基的对数）的。

临床检验上，斑点分子杂交技术已应用于乙型肝炎病毒DNA的检测。

2.2 细菌的原位杂交技术
将培养基上长出的菌落通过影印的方法转移到硝酸纤维素膜上，碱变性破坏细菌细胞壁使其释放出DNA，并做变性处理，使双链DNA解链，经烤干固定后，用同位素标记的探针进行杂交，最后放射自显影。

如果底片上出现蝌蚪黑点，即证明相应的菌落中具有与探针DNA同源的核酸片段。

应用细菌原位杂交方法来
筛选和鉴定重组DNA克隆的菌落有很大的实际意义，在技术上与斑点杂交相似。

噬菌体原位杂交是先将噬菌体与指示菌混合感染，接种于琼脂培养基中，待形成空斑的琼脂培养基上，使DNA吸印到膜上，再经变性处理，干烤固定后与核酸探针杂交。

原位杂交技术现在还广泛应用于研究高等生物中的基因定位、单个细胞水平的基因扩增，待定核酸序列在染色体上的分布以及某些病毒病因的探讨等。

2.3 Southern吸印杂交
又称凝胶电泳印杂交技术是Southern，E、M、于1975年建立的一种DNA 转移方法[3]。

该方法利用硝酸纤维素膜具有吸附DNA的功能，先以限制性内切酶消化待测的DNA片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性，解离为两条单链。

在在凝胶上贴盖硝酸纤维素膜，使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。

然后直接在膜上进行同位素标记的核酸探针与被测样品之间的杂交，再通过放射自显影对杂交结果进行检测。

此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，它巧妙地将电泳技术与杂交技术结合起来，不仅可以定位到确定DNA中的特异序列，而且还可以根据DNA片段在凝胶中的泳动距离，确定特异DNA片段分子量的大小及其含量。

2.4 Northern吸印杂交
这是在Southern blot的基础上发展的RNA固相杂交技术，其因两技术相类似而得名。

其方法与Southernblot一样。

但RNA需先经乙二醛等变性剂处理后，再于合适的条件下电泳，这样便能使充分变性的RNA像变性DNA一样直接转移到NC膜上。

固定之后除去变性剂，再进行杂交，可大大提高杂交的敏感性，每条区带所需的RNA量可从500pg降低到1pg以下[4]。

此外，由于有时需要分离的核酸样品分子量很小，用琼脂糖凝胶不能达到要求的分辨率。

这种情况下往往需要聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分离，而由于这种胶的孔经较小，用前述的吸印转移法转移速度缓慢，易造成转移不完全。

为了解决之一问题，发展了电泳转移法。

即以电泳的方法使分离后的待测核酸样品从凝胶转移到NC膜或DBM纸等固相支持物上，再进行杂交。

3 核酸分子杂交技术的应用
Southern印迹技术用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，特异性非常高，而且还可知道其大小及酶切位点的分布，尽管其操作比较复杂；Northern印迹技术则用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录；点印迹则仅需要一滴液体的样品，就可快捷地检查出其中是否有某个基因，但不能检出基因的大小或重复的程度；菌落原位杂交技术则是基因克隆中，从众多克隆中快速筛选出阳性克隆的最常用的一种方法。

V.Davis(1990)通过病毒基因组的随机引物逆转录制备了IBDV的互补DNA 探针。

在点印迹中，探针不能区分病毒的疫苗株、田间株以及突变株，但在很严格的条件下也可获得一些特异性。

V.Vakharia用按澳大利亚IBDV序列合成的引物以及pGEM系统，制备了已知起始位点的克隆。

将从Delaware E株、Grayson 株和STC标准毒株获得的RNA从琼脂糖凝胶转移到膜上并用放射性标记的探针检查。

只需1小时的放射自显影。

但探针不能区分病毒的不同毒株。

他用非放射性的地高辛配基系统也获得了好的杂交结果。

Shaohua Zhao等(1990)通过将滑液膜支原体(MS)的WVU1853株克隆到质粒载体pUC18上，并用大肠杆菌转化，构建了MS的基因文库。

在点印迹中，4个转化的克隆与放射性磷标记的MS染色体DNA杂交，但与MGS6株的染色体DNA则没有杂交。

在Southern印迹中，所有氯化铯纯提的重组质粒克隆都含有2个长度在1.0～2.3kbp的MSDNA片段[5]。

用4个重组质粒制备的探针在点印迹中与MS的WVU1853株和9个田间株均可杂交，但与MG及禽支原体其它15个种均无杂交。

M.L.Khan等已制成用来区分MG致病株和疫苗株的DNA探针[6]。

对于MG 感染的快速诊断，他将株和种特异性的DNA探针直接应用在田间样品的点印迹检测上。

将1毫升的样品培养液吸到膜上，然后用探针检查。

株特异性的探针具有与MG疫苗株相同的、长度为6kbp的基因序列，它能特异性地检出经MGF 株苗免疫的鸡群。

种特异性的探针含有1个9kbp的插入片段，它可检测出所有的MG，而与其它的鸟类支原体则无交叉杂交。

M.Jenkins用Southern印迹来研究球虫的基因表达、基因的基因组构成以及它们在球虫不同种的分布。

能特异性地鉴别球虫特定的发育阶段的探针也已制备。

此外，还研制出了以诊断为目的、具有种特异性的其它探针。

K.S.Henderson等(1990)通过点印迹法，用cDNA探针来检测感染鸡体内的IBDV抗原，并用琼脂扩散试验和免疫荧光试验来作比较。

结果用后两种方法在接种病毒2天后即可从鸡的组织中检出病毒抗原，检出的持续时间分别为3天和4天。

而用点印迹法在接种病毒后1天即可检出病毒抗原并且在整个试验期里(24天)均可检出。

这表明点印迹法比其它两种方法都敏感。

K.P.Snipes等(1990)应用REA及Southern印迹法可将分离自火鸡的多杀性巴氏杆菌的疫苗株(M9)和致病株相鉴别，尽管两者在血清型或荚膜型、生化特征、抗药性、全细胞蛋白的PAGE图以及质粒的内容等方面完全相同。

为禽霍乱流行病学研究提供很有用的工具。

除上述这些应用之外，分子杂交技术还可用于进行细胞原位杂交。

此项技术是在保持细胞，甚至单个染色体形态的情况下，检查细胞内某些基因位置的一种有效的分子工具。

它在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。

原则上它保持了核酸和细胞的形态，用标记的探针与之杂交，最后显影。

影响试验的因素包括基因的性质及探针的大小。

在包埋的或冰冻的切片中的待检样品用固定剂处理。

交联固定剂如甲醛，可降低细胞的渗透性，这样反过来就需要较小的探针才能使之透入细胞，结果就使此方法的灵敏度下降。

因此，固定剂及探针的选择是关键。

探针可用被荧光标记或与酶联结的放射性核苷酸来标记。

原位杂交是一项很难掌握的技术。

因为许多的实验条件都很关键。

E.Tanizaki等(1990)用生物素标记的探针与经福尔马林固定的鸡皮肤上皮细胞进行原位杂交，以检查禽痘病毒(FPV)在感染细胞内的分布。

结果表明FPV的DNA局限于细胞浆内。

D.Tripathy发展了一种凝胶原位杂交。

杂交可接在琼脂糖凝胶上进行，而不需将其转移到固体载体上。

由于减少了一个步骤和取消了膜的使用，从而使此方法简单化、缩短了时间，而且减少了经费的使用。

4 展望
尽管核酸分子杂交技术的应用越来越广泛，但其在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第
三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。

参考文献
[1]尹和平,张世荃.简述核酸分子杂交技术[J].生物学通报.1992(6):45-100.
[2]王毓平.核酸分子杂交技术及其应用[J].井冈山医专学报.1996(1):335-338.
[3]Schuster,V. et al. The Journal of Infectious Diseases .1986(8):80-85.
[4]张玉砚.核酸分子杂交技术简介[J].细胞生物学杂志.1980(2):90-98.
[5]Blum,HE. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1983(6).49:198.
[6]Douglas,D. et al. The Journal of Infectious Diseases.1984.149:198.。