自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.

自然界中产淀粉酶菌株分离

纯化及酶活测定

淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和

葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等a-1,4-葡聚糖，水解a l, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为a淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与禺淀粉酶（EC 3. 2. 1.2.）。a-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；3■淀粉酶与a-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断a1,4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘署、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。

70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1,2]。除动物自身的消化

道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp.，Strepiococcus boris Bacillus circulans，Chalara paradoxa 等菌种均有产淀粉酶能力。

本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm 土层取土壤样品

中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定[8]。同时，拟进

行发酵条件的优化以提高菌株的酶产量，分离提纯产生的淀粉酶并进行酶活力测定，为利用该菌株进行工业化生产淀粉酶提供初步的理论依据。 1.材料和方法1.1

实验材料1.1.1分离材料

种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm 土层取土壤样品。1.1.2培

养基

(1 PDA固体培养基[9]:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL。pH

5.5~

6.5 之间，121 T 灭菌20 min。

(2平板筛选培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g , NaCI 5g,可溶性淀粉20g，琼脂

15~20g, pH 自然，121 C灭菌20 min。

(3发酵培养基[10]:蛋白胨10g，牛肉膏5g , NaCl 10g, pH 7.0, 121 C灭菌20 mi n。

(4 LB培养基: 蛋白胨10g，酵母膏5g , NaCl 10g，琼脂20g , pH自然，121 C 灭菌20 mi n。

1.1.3主要试剂配制

DNS试剂[11]:酒石酸钾钠18.2g ,溶于50mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸0.03g , NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，室温保存。

CTAB法所用主要试剂：提取缓冲液：2 CTAB提取液(2%CTAB , 200 mmol/L Tris-HCI (pH8.0, 50 mmol/L EDTA(pH8. 0, 1.4 mol/L NaCl ); 10 >CTAB 提取液(10%CTAB, 0.7 mol/L N aCl ; TE 缓冲液:100 mmol/L T ris-HCl (pH8.0 , 10 mmol/L EDTA (pH8.0。

电泳缓冲液：取50X TAE (242 g Tris碱和57.1 mL冰乙酸溶于100 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH8.0溶液中，加去离子水至1000 mL) 20 mL加蒸馏水至1000 mL；溴化乙锭(EB :称取5 g溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB，溶于蒸馏水中并定容到10 mL ,避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍，使其最终浓度达到0.5卩g/n；1.0%的凝胶：称取琼脂

粉1.0 g,加热使之溶于100 mL的电泳缓冲液，加入5卩L EB混匀。

氨苄青霉素(Ampicillin )(100 mg/mL):溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL。分装成小份于-20°C贮存。以50卩g/ml的浓度添加于

生长培口养基。

大肠杆菌质粒提取相关试剂：溶液I: 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

Tris.HCI(pH8.0 , 10mmol/L EDTA ;溶液II : 0.2 mol/L NaOH，1%SDS混合液(使用前新配制；溶液III : 5 mmol/L KAc溶液pH 4.8;去离子水：双蒸水灭菌得到；酚:氯仿:异戊醇(25:24:1);无水乙醇；75%的乙醇。

克隆相关试剂0.05 mol/L CaCl2溶液；含15%甘油的0.05 mol/L CaCl2溶液；克隆克隆试剂盒(宝生物工程有限公司：pMD19-T Vector*1(50 ng/ » Lcontor insert

(50 ng/ LSolution I、X-Gal、IPTG、Amp。1.1.4 主要化学药品和试剂

本实验中用到的主要化学药品和试剂如表1-1所列。

表1-1主要化学药品和试剂

名称纯度来源

蛋白胨分析纯杭州微生物试剂有限公司牛肉膏分析纯杭州微生物试剂厂硫酸铵分析纯上海化学试剂有限公司氯化钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠分析纯金山区兴塔美兴化工厂3，5-二硝基水杨酸

分析纯上海晶天生物科技有限公司苯酚分析纯杭州双林化工试剂厂氢氧化钠分析纯上海虹光化工厂