化学发光法在梅毒血清学检测的应用

阳性
阴性
TRUST阴性 TPPA阴性 CLIA阳性 ELISA阳性 免疫印迹阴性
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
梅毒检测----不同的技术带来的敏感性和
特异性差异显著
检测方法
暗视野显微镜检查 PCR VDRL RPR
Western Blot Chemiluminescence
其中恶性肿瘤47例 糖尿病31例 自身免疫性疾病37例 妇科相关疾病15例 心血管疾病41例 肝硬化8例 感染13例 骨折2例 其它疾病9例
再统计，203例患者中50岁以上的老年人占64%---真阳？假阳？ 现有大量研究表明老年人是恶性肿瘤﹑糖尿病﹑ 类风湿性关节炎等疾病的 高发人群，而且这些疾病可使患者体内含有某些治疗性抗体﹑嗜异性抗体 ﹑自身糖尿病抗体类风湿因子﹑甲胎蛋白等会导致CMIA测定梅毒抗体阳性， 是否这些抗体造成CMIA测定梅毒抗体的假阳性仍需要进一步的研究。
7、灵敏度 100% observed sensitivity and Seroconversion Sensitivity
8、精密度 Total CV% 3.7 – 8.8
Results
The ARCHITECT CLIA and the TPPA were in total agreement for all untreated infection with a sensitivity of 98.4%.
密螺旋体抗体试验(TrAT)所测的为-------抗TP的IgG/ IgM类抗体
• 即用密螺旋体抗原检测患者血清中特异性抗 体，具有更高的特异性和敏感性，主要用于 梅毒的确证，不适用于疗效考察。
• 试验中所用抗原:
. 或为TP 的Nichols株冻干悬液( FTA-ABS) ; . 或为Nichols株超声处理(或SDS提取)的材料
诊断
《梅毒诊断标准》（2007）指出，梅毒诊 断须根据病史、临床症状、体格检查及实 验室检查等进行综合分析，慎重诊断
梅毒实验室检查对诊断具有重要性意义
梅毒血清学模式
Infection
IgM
IgG
VRDL/RPR
Antibody titer
0 2 4 6 Weeks 感染时间
6 Months
>1 Year
TPHA/TPPA IgG-ELISA IgM-ELISA
各个感染阶段的敏感性(%)
一期
二期 隐性梅毒 晚期梅毒
76
76
---
---
95
95
95
95
74–87
100
88–100 37–94
77–99
100
95–100
73
99
100
100
99
98
100
100
100
86
100
100
99
98
100
64
96
10例＞1
（1.2~4.99）
2例＜1
（0.4~0.49）
雅培 i2000 的不同 S /CO 值和 TPPA 法检测标本结果比较
CMIA S/CO值
1.00-4.99 5.00-9.99 10.00-14.99 15.00-19.99 ≥20
合计
TPPA
阳性 104（38.1%） 113（78.5%） 92 （93%） 72 （96%） 355（100% 736（77.8 %）
(TPHA、TPPA) , . 或为纯化的/基因重组的的TP特异抗原(ELISA、
金标记免疫层析、免疫印迹) 。
梅毒检测流程---各国检测流程不同
（尚无检测金标准）
欧洲
美国
• 梅毒螺旋体抗原试验可单独用 于筛查
• 不建议将非梅毒螺旋体抗原试 验用于筛查（感染晚期灵敏度 较差，存在生物学假阳性）
• 过去: 用非梅毒螺旋体抗原试验进行 筛查，有反应性的样本用梅毒 螺旋体抗原试验进行重测
5、样品类型多样：血清、血浆（EDTA-K、肝素钠等） 6、特异性
Donor 99.80% based on 5000 specimens -upper and lower 95% Confidential Limits of 99.90% and 99.63% Clinical 99.65% based on 564specimens-upper and lower 95% Confidential Limits of 99.96% and 98.72%
1 1.05
1. 1 1.25
2 5 10 100 500 700
无需灰区
减少重复检测
为临床快速决策提供辅助指导
1800 1600 1400 1200 1000
800 600 400 200
0
对 2,832份样本进行筛查
1,537
Cut-off
678
10
63
26
152 116
23
23
8
6
2
3
2
1
1
3
0
1
2
15
110 19
40
0
Cut-off index
数据: Elecsys® Syphilis development files, R&D Dept., Penzberg
VDRL RPR TRUST
梅毒螺旋体抗原试验
FTA-ABS TPHA/TPPA ELISA/CLIA WB/TPI/金标
筛查实验
TP-ELISA TP-CIA
确证实验
TPPA TP-WB
非密螺旋体抗体试验（NTrAT）所测-----抗类脂抗体,也称反应素
• 多用牛心肌的心脂质作为抗原，测定患者血清中的反应素（抗 脂质抗体）。初期梅毒病灶出现后1～2周，血清中反应素的阳 性率为53％～83%，二期梅毒的阳性率可达100%，晚期梅毒 的阳性率为58％～85%，胎传梅毒的阳性率为80％～100％。
• 这些试验在老年人、自身免疫病( SLE、干燥综合征、类风湿性 关节炎、抗磷脂抗体综合征等) 、恶性肿瘤、麻风病、动静脉 血栓形成、反复自然流产以及吸毒者中都有一定的阳性率。
• 不仅适用于一、二期梅毒的诊断、疗效观察以及复发或再感染 的检测，也适用于大量人群的筛查、婚检、产前检查和其他健 康查体等。此类试验阳性时需用密螺旋体抗原试验进行确证。
同时检测特异性 IgM + IgG = 早期诊断
梅毒实验室检测策略
非梅毒螺旋体抗原血清试验(测抗类脂抗体) NTrAT
快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) 甲苯胺红Hale Waihona Puke Baidu加热血清试验（TRUST） 性病研究实验室试验 (VDRL)
梅毒螺旋体抗原血清试验(测抗TP抗体) TrAT
梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA） 梅毒金标记免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） 化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒IgM抗体检测（IgM） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）
加入预触发液和触发液 测定得到化学发光反应物的相对光单位（RLUs）
雅培ARCHITECT Syphilis TP特点
1、全自动CMIA技术，高通量200tests/h
2、应用3个重组的TP抗原包被磁微粒子： pN15,TpN17 ,TpN47
3、吖啶酯标记的抗Human IgM、IgG抗体 ,
4、两步法检测TP特异性总抗体, 第一个结果29min
合计
阴性
（例）
169
273
31
144
7
99
3
75
0
355
210 （22.2%） 946
得出CMIA测定梅毒抗体的S/CO最佳分界点：6.815， 此点的灵敏度：0.800，特异度：0.865.
CMIA与TPPA结果不一致的210例，结合临床资料分析分布:
. 7例经临床确诊是梅毒患者， . 203例患者经临床确诊均非梅毒患者（？）
This was significantly higher than the sensitivity of: Murex ICE assay 86%, p=0.0005, IgM-EIA 86.8%, p=0.0008, and VDRL 83.7%, p= 0.0001
The difference in the sensitivity of the ARCHITECT and ICE assays was entirely due to primary stage syphilis, 97.5% versus 77.2% (p=0.0003).
(CE) China
(CE) Italy
(CE) Thailand
(Lot to lot) Turkey
罗氏：阴性与阳性结果有明确的cut-off值
样本数量f (频率)
0 0.05 0.075
0. 1 0.15
0. 2 0.25
0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 0.75 0. 8 0.85 0. 9 0.95
重组TP抗原（TpN15、TpN17和TpN47）包被微粒子与检验稀释液混合
包被三种抗原：
样本中存在的抗-TP抗体将结合到TP包被微粒子上
TpN47 TpN17 TpN15
抗-人吖啶酯标记结合物
ARCHITECT Syphilis-1D2001-E Date: July 2005
Company Confidential © 2005 Abbott- Not for Customer Distributions
特异性梅毒螺旋体抗体血清试验 （ELISA、 TPPA、 TP-CLIA等）
阳性
阴性
TRUST定性/定量检测
报告：
TP-CLIA阴性
阳性
阴性
ELISA阴性
报告：
报告： TRUST阳性（及滴度） TPPA阳性 发光及ELISA阳性 免疫印迹阳性
报告： TRUST阴性 TPPA/CLIA阳性
推荐TPPA/WB复检
经典策略 采用任何一种非梅毒螺旋体 抗原血清试验对样品进行初 筛
新策略 采用任何一种梅毒螺旋体抗 原血清试验对样品进行初筛
7
梅毒的检测方法---病原学/血清学
梅毒实验室检测
抗原检测
抗体检测
暗视野显微镜检 镀银染色 核酸检测 兔感染试验
除核酸检测外，其余 方法繁琐，不适合实
验室常规检测
非梅毒螺旋体抗原试验
化学发光法在梅毒血清学检测的应用
中山大学附属第一医院 刘敏
梅毒 中国流行情况
Infections grew 8 times from 2003-2013 400,000 new Syphilis infections / year
Source: Syphilis in China from 2000 to 2013 epidemiological trends and characteristics
梅毒传播途径及高危人群
需加大对高危人群的筛查
梅毒传播途径
输血
性接触 母婴传播
• 高风险人群:
• HIV患者(梅毒感染增高HIV传播和感染的风险)
• 男男性行为者(MSM) • 静脉注射吸毒者 • 性工作者
先天性梅毒
梅毒通过胎盘由母亲传播给胎儿，发生先天性梅毒。梅毒感染早期的母亲传播梅毒给胎儿的 机率最高,但是整个怀孕期，甚至分娩时，母亲都能传播梅毒给胎儿。
为何选择化学/电化学发光法 ?
• 自动化（高通量）
• 低成本（高样本量的情况下）
• 更少的实验室职业危害
• 结果客观
VS
• 检测IgM/G抗体，可用于诊断非常早期的感染
US CDC: reverse sequence syphilis screening
雅培检测原理: 两步法，化学发光微粒免疫分析（CMIA），检测 人血清和血浆中梅毒螺旋体（Treponema Pallidum，TP）抗体（IgG＋IgM）
罗氏检测原理: 双抗原夹心法， 检测时间18 分钟
快速
高效
全自动
Roche internal data
罗氏梅毒免疫检测性能评估
CE 认证和批间比较研究 （6个中心）
(CE) Germany, 3 sites
(Lot to Lot) Germany
(CE) Austria
(Lot to Lot) Austria
93
85
特异性 (%)
-->99 96–99 93–99 100 99 96 70–99 99
Peeling, Ye. Bull World Health Organ 2004; Seña et al. Clin Infect Dis 2010; Binnicker. Curr Opin Infect Dis 2012.
• 现在: 大样本量的实验室已经开始使 用自动化梅毒螺旋体抗原试验 进行筛查，用非梅毒螺旋体抗
原试验做确认。
WHO. 1999; CDC. 2010; Workowski et al. MMWR Recomm Rep 2010; French et al. Int J STD AIDS 2009.
梅毒血清学试验流程及报告