DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
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D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步
骤
公司内部编号:(GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂:
1、30%聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克,Bis1克,水100ml。
2、10%过硫酸胺
过硫酸胺1克,水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克,硼酸13.75克,0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml,定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液:100ml无水乙醇,5ml冰醋酸,定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3:AgNO3 1克,水500ml。
3、1.5% NaOH:NaOH 7.5克,水500ml。
4、37%甲醛。
三、配胶(6%):
30%聚丙烯酰胺(29:1) 8ml,5xTBE 8ml,定容至40ml,加10%过硫酸胺 200ul;TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。
四、银染:
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml +37%甲醛50ul,混匀,避光染色30~50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml,加37%甲醛 0.5ml,混匀,显色3~10m。
6、水洗若干次,终止显色。
电泳时间:150v x 3h,溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10%。
在终止显色过程中,将依惯性继续显色,所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄,水浸泡过夜将使背景加深转贴!!!
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选,取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度,背景干扰降到最低,因此在对凝胶进行染色时,往往采用同位素法或银染法,而且配制的胶往往很大,我们配制的是大约40×35cm的胶,0.4mm厚。同位素十分灵敏,特异,但是由于其操作的复杂性,许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行,便于一般的实验室开展。
需要指出的是,应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法,这样才能保证灵敏性,我们在长期的工作中积累了一些银染的经验,与大家分享。
下面是网上的一个银染方法,我们使用后觉得效果不错,然后以此为基础,介绍一下我们的经验
测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液,用于终止显影反应。
3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶3次,每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒,使水流尽。
4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影:
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注重,把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次2分钟,注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸)上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
经验分享:
(1)固定液:网上有好几种固定液的配制方法,我们采用的是10%的冰乙酸,用蒸馏水稀释即可,简便易行。可提前配制,室温放置。
(2)染色液:我们用的是0.1%的硝酸银溶液,加入3ml甲醛。硝酸银要现用现配,时间长了硝酸银会分解,一般在固定的时候配制,要有一段时间让硝酸银充分溶解。
(3)显影液:用10%碳酸钠,北化的质量就不错,完全不用买进口的,显影液要提前配制,放入4度冰箱预冷。这一步很重要,假如没有充分预冷,显色时很难控制显色时间,不是染过了导致背景很高,就是染的很浅。因此在固定前就要把显影液配好。
(4)在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制,这一步要在显影前加,不要提前加。原理忘记了,但是一般都是这样做的。
甲醛将银离子还原为金属银,硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则会增加背景。甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的,根据凝胶染色的效果决定。当时我是把甲醛调整为2.7ml,硫代硫酸钠改为420μl,两者作用不一样,所以调整的时候一个多,一个少,而且要微调。具体什么方向调整忘记了,需要摸索最合适的条件。
(5)也是比较重要的,即一定要分两次显色,第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显影液中。显色时间第一次大概是5分钟左右,操作中一定要在边上看着。显色后马上放入终止液(10%的冰乙酸)中,两分钟后放入纯水中即可,两分中后取出即可。
(6)对我来说教训最为惨痛的,即显色时间的控制。第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止,因为显色有一个延续效应。当时我染色时,忽然走神了,就走神5秒钟,胶全黄了,背景奇高。我两天的工作因为5秒钟全部over了,当时差点疯了。
我的经验是:当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止,具体时间需要摸索,但一定要提前终止。再加一句:万一染色浅了是可以复染的,效果差不太多。十分感谢!顶下,不错求助:DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong你好,我想请教下:我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠,有的文献上没有加,我第一次做这实验不清楚,到底这个加不加会影响很大吗?aifuhong你好,我想请教下:我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电