酶切连接经验之谈
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酶切
本实验室条件下酶切连接经验之谈
1、PCR产物可以切胶回收后酶切,用Elution buffer溶解即可,不影响后续实验。
2、50ulPCR产物切胶回收后用35ul Elution buffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可
满足要求。
3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应,但需取少于一半的量用于后续实验,
否则会不能完全切开而导致实验失败。
4、双酶切时,若2种酶不是同一厂家时,可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer,
选用Tango缓冲液,一般50ul体系各加1ul酶,而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。
5、添加酶切试剂时,应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶,轻弹混匀即可。
6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多,PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大,
并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带,由此可以判断是否切开。
7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割,如FbaI和MboI等,一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。
大多数酶切位点的甲基化不影响切割,而有些会影响,如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列,以XbaI为例,只有在位点序列旁出现GA或TC,该XbaI位才会被甲基化。
而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法:
(1)选用上述酶的同功酶,如Sau3AI,DNA识别切割位点与MboI相同;但不受甲基化影响;
(2)利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备,如E.coli JM110和链霉菌等,前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出,而后者细胞内本就没有甲基化酶,从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
8:E.coli JM110
要排除dam,dcm甲基化的影响,需要用特定的dam-,dcm-的菌株,如JM110
如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒,则不会被甲基化.
若酶切不成功可以考虑以下因素的影响
a)有些内切酶对PCR产物酶切效率较低
b)双酶切无共同buffer时,可以采用分步酶切
c)PCR产物直接双酶切不成功,可以选择先做TA克隆后再双酶切
d)当载体的2个酶切位点很接近,或者其中一个酶切效率很差时,可以对载体进行去磷酸
化,该酶为牛小肠碱性磷酸酶,在大多数限制酶缓冲液中均有活性
e)导致“星星活性”可能是体系中甘油浓度过高、高PH、较低的离子强度所致。
连接
1、一定要选择未经过反复冻融的连接buffer,并准确加入,确保其终浓度准确。
2、目的片段和载体比例不是影响连接成功与否的关键原因,依据经验,取相等质量的的目
的片段和载体即可,载体可以尽量少加一点。3ug 载体(5kb)相当于2pmol 线性DNA 或者4pmol双酶切产物。
3、多个片段连接时,体系中,终浓度的各个片段与载体相同即可。
4、高质量的连接反应无需灭活,可直接用于转化。
5、连接90min即可满足实验要求。
提高连接效率可以参考以下操作
a)如需连接的片段和载体冻存多时,可以先55℃变性10min后立即冰上退火,再在冰上
操作,加入其它组分等
b)对于连接效率较低的情况下,可以用PCR仪在16℃和4℃之间循环。