DNA和CDNA文库构建
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3．文库的连接转化或包装侵染
寻找最适的载体与基因组之间的比例。 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA 的转化效率也有所不同。
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4．文库的质量检测
克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度 越高，文库质量就越好。
的比值
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例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
平均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb N=ln（1-p）/ln（1-f） =690773.2
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（三）、基因组DNA文库的构建流程
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基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：
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1．基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。
2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量
要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库 最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片 段越大。
① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size
selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。
一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。
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Biblioteka Baidu
（四）、亚基因组文库
指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
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例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交 显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上 则可将Spel酶切的 基因组DNA中的 8.3kb片断回收，用 于构建DNA文库。
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2、均一化cDNA文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立
cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度 基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等 丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致， 这种cDNA文库称均一化cDNA文库。
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3、cDNA文库的构建
完整性，间接判断mRNA的完整性。 如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条
带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。 mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
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2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
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插 第22页/共68页
1）mRNA的完整性及mRNA的富集 通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的
100kb—1Mb）
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（二）文库的代表性和随机性 文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可 以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任 何一段基因组DNA。
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一个完整基因组文库应包含克隆的数目，
Clark和Carbon公式： N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小
一、基因文库
某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。
某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。
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基因文库（gene library)： 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。
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基因组DNA文库
基因文库
cDNA文库
基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具 有时空特异性。
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基因文库的应用： 构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因
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二、基因组DNA文库的构建
（一）基因组DNA文库的类型
质粒文库， （﹤10kb) 噬菌体文库，（0-23kb ) 粘粒文库， (~45kb) 人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库，
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3)第二链cDNA的合成
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三、cDNA文库的构建
1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，
构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。
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根 叶 花 花药 茎 穗下节 幼胚 GAmyb
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2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%
外源DNA片断、载体、宿主
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构建基因文库的基本程序：
（1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA 片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA，
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
3．文库的连接转化或包装侵染
寻找最适的载体与基因组之间的比例。 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA 的转化效率也有所不同。
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4．文库的质量检测
克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度 越高，文库质量就越好。
的比值
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例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
平均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb N=ln（1-p）/ln（1-f） =690773.2
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（三）、基因组DNA文库的构建流程
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基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：
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1．基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。
2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量
要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库 最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片 段越大。
① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size
selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。
一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。
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Biblioteka Baidu
（四）、亚基因组文库
指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
第15页/共68页
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交 显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上 则可将Spel酶切的 基因组DNA中的 8.3kb片断回收，用 于构建DNA文库。
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2、均一化cDNA文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立
cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度 基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等 丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致， 这种cDNA文库称均一化cDNA文库。
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3、cDNA文库的构建
完整性，间接判断mRNA的完整性。 如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条
带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。 mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
第23页/共68页
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
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插 第22页/共68页
1）mRNA的完整性及mRNA的富集 通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的
100kb—1Mb）
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（二）文库的代表性和随机性 文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可 以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任 何一段基因组DNA。
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一个完整基因组文库应包含克隆的数目，
Clark和Carbon公式： N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小
一、基因文库
某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。
某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。
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基因文库（gene library)： 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。
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基因组DNA文库
基因文库
cDNA文库
基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具 有时空特异性。
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基因文库的应用： 构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因
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二、基因组DNA文库的构建
（一）基因组DNA文库的类型
质粒文库， （﹤10kb) 噬菌体文库，（0-23kb ) 粘粒文库， (~45kb) 人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库，
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3)第二链cDNA的合成
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三、cDNA文库的构建
1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，
构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。
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根 叶 花 花药 茎 穗下节 幼胚 GAmyb
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2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%
外源DNA片断、载体、宿主
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构建基因文库的基本程序：
（1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA 片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA，
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。