3_5_二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究

第12卷第3期2004年9月纤维素科学与技术

Journal of Cellulose Science and Technology

Vol.12 No.3

Sept. 2004

文章编号：1004-8405(2004)03-0017-04

3,5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究

齐香君，苟金霞，韩戌珺，闫博

（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西咸阳 712081）

摘要：据相关资料报道，在碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生

成的氨基化合物在540 nm波长下具有最大吸收，在此条件下该方法可测糖的

适合浓度为3~4 mg/mL。而对其吸收光谱的测定研究发现，生成的氨基化合

物在483 nm处有最大吸收，在该波长下测糖范围是0.1~1.0 mg/mL，并且测

量的相对误差为2.2%。

关键词：3,5-二硝基水杨酸；还原糖；最大吸收波长；测量范围

中图分类号：Q53 文献标识码：A

众所周知，还原糖测定在我们生产细菌纤维素的发酵过程中具有十分重要的意义。由于3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）具有准确性高、重现性好、尤其适用于大批量样品的测定等特点，而广泛地被用来测定发酵液中的残余糖量，从而得出细菌在繁殖和合成纤维素的过程中的耗糖量。

据相关资料报道[1,2]，在碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化合物在540 nm波长下具有最大吸收，在沸水浴中显色时间2 min，在此条件下该方法可测糖的适合浓度为3~4 mg/mL。而我们对其生成的氨基化合物的吸收光谱进行了研究，发现其λmax 不是540 nm，因此本文对3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的方法进行探讨与研究。

1 原理与方法

1.1 原理

在氢氧化钠和丙三醇的的存在下，还原糖能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成氨基，生成氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在一定波长下具有最大吸收，并且吸光度与还原糖含量有线性关系。

1.2 适用范围及特点

此法适用于各类食品中的还原糖的测定，具有准确度高、重现性好、操作简便、快速等优点，尤其适用于大批量样品的测定。

收稿日期：2004-05-21

作者简介：齐香君（1957~），女，教授，研究生导师，主要研究方向：生物制药研究。

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纤 维 素 科 学 与 技 术

第12卷

1.3 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂的配制

配制方法同文献[1,2]：称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL 容量瓶中，加2 mol/L 氢氧化钠溶液325 mL ，加45 g 丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL 。 1.4 吸收光谱的测定

用干燥葡萄糖配置一定浓度的葡萄糖溶液，取1 mL 葡萄糖溶液置于25 mL 的容量瓶，加2 mL DNS 液在沸水浴中煮2 min 显色，流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。 1.5 显色时间的确定

取1 mL 葡萄糖溶液置于25 mL 的容量瓶，加2 mL DNS 液在沸水浴中进行不同时间的显色，流水迅速冷却定容摇匀，以空白调零。 1.6 葡萄糖含量与吸光度的关系

取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/mL 的葡萄糖标准溶液各1 mL ，分别置于25 mL 容量瓶中，各加2 mL DNS 液，置沸水浴中煮一定时间，流水迅速冷却，定容摇匀，以空白调零。在最大吸收波长处测吸光度，绘制葡萄糖含量与吸光度的曲线关系，并讨论其相对误差，进而对其最适测量范围加以确定。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱的测定

我们用760CRT 双光束紫外可见分光光度计对反应生成的氨基化合物（空白调零）以及DNS 液（蒸馏水调零）的吸收光谱进行了扫描，扫描结果如图1、2。入射光的波长应根据吸收光谱，以选择溶液具有最大吸收时的波长为宜[3]，以及由图1、2可知选λmax ＝ 483 nm 为合适，这一点与宋占午等[4]的报道相一致，然后我们在此波长下确定显色时间以及由绘制出的葡萄糖含量与吸光度的曲线关系最终确定测还原糖的合适范围。

2.2 吸光度与显色时间的关系

显色时间与吸光度的考察结果如表2，由表2及图3可看出在前1.0 min 内3,5-二硝基水杨酸由于被迅速还原而吸光度急剧增大，在显色1.5 min 之后吸光度的变化趋于平缓，即显色时间在1.5 min 即可。

0 2

1

0 1

2

波长/ nm 波长/ nm

图1 3,5-二硝基水杨酸吸收光谱(以蒸馏水调零) 图2 氨基水杨酸的吸收光谱(以DNS 液调零)

300

340 380 420 460 500

540

400 440 480 520 560

600 吸光度A

第3期

齐香君等：3,5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究

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表1 显色时间与吸光度的关系

显色时间/ min 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 吸光度A

0.387

1.165

1.233

1.235

1.289

1.302

2.3 还原糖测量范围的确定

葡萄糖含量与吸光度的关系如表2，我们发现葡萄糖含量（mg/mL ）和相应的吸光度（A ）具有一定的线性关系（如图4），且其回归方程为：у＝0.8309 x + 0.0098，R ＝0.9998。

表2 葡萄糖含量与吸光度的关系

葡萄糖含量/ mg·mL -1

0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.50 吸光度A

0.218

0.428

0.637

0.850

1.044

1.266

1.470

1.651

*

注：*表示已超出测量范围

图3 显色时间与吸光度的关系

00.20.40.60.811.21.4

0.5

1

1.5

2

2.5

3

显色时间/ min

吸光度 A

图4 葡萄糖含量与吸光度的关系

0.20.40.60.811.21.41.61.80

0.5

1

1.5

2

2.5

葡萄糖含量/ mg·

mL -1吸光度 A

由于在不同吸光度范围内读数对测定会带来不同程度的误差[4]，由比耳定律可知，只有当吸光度（A ）在0.15~1.0的范围内，测量误差才能在2.2%之内。若吸光度过小或过大，误差都会很大，由表2可知，在0.15~1.0的吸光度范围内，测糖范围是0.1~1.0 mg/mL 。

3 结 论

在碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化合物在483 nm 波长下具有最大吸收，在沸水浴中显色1.5 min 为宜，在此条件下该法测糖适宜浓度为0.1~1.0 mg/mL 。 参考文献：

[1] 大连轻工业学院, 华东理工大学, 郑州轻工业学院，等. 食品分析[M]. 北京: 中国轻工业

出版社, 1999.

[2] 宁正祥主编. 食品分析手册[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1998.

[3] 华东理工大学分析化学教研室, 成都科学技术大学分析化学教研组编. 分析化学[M]. 第

四版. 高等教育出版社, 1995.

[4] 宋占午, 王莱, 刘艳玲. 3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件考察[J]. 西北师范大学

学报(自然科学版), 1997(33): 52-55. （下转第30页）