核酸分子杂交与应用

(2)亚精胺即可促进γ-32P-ATP的掺入， 又能抑制核酸酶的活性 。 (3)脱磷酸的DNA样品最好经电泳纯化以 除去其中存在的低分子质量的核酸，否 则会竞争性抑制目标DNA的标记 。
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探针的线纯化 凝胶过滤柱层析法
利用凝胶的分子筛效应，将 标记的DNA与小分子彼此分 开。因标记的探针量很小， 一般用离心柱层析法。 乙醇沉淀法
(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入
1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记
核苷酸)，37oC保温一小时。
(5)Sephadex G－50柱层析或乙醇沉淀法分
17.07离.2020标记的DNA片段。精品课件
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5’末端标记
标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化 下，可使 ATP分子上的γ磷酸基团转 移到DNA或RNA分子的5’－OH基团上。 因此采用γ-32P-ATP为底物，即可将 DNA样品5’端标记。但核酸样品5’ 端必需是去磷酸的。
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T4DNA聚合酶， 无dNTP
加入dNTP,其中一种为标记核苷酸
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标记反应步骤：
(1)在反应管中加入下列试剂并混匀
DNA
0.2~0.5μg 1xT4DNA聚合酶缓冲液
2μl
加水至
2(02μ)加l 入所需的限制酶，并在适当条件下
温育 (3)加入适量T4DNA聚合酶。
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
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影响变性的因素：
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3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。3’ 末端标记法包括限制酶切和聚合酶合 成两个过程，3’标记有两种方式：
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
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时。加入2ul0.5mol/LEDTAz终止
反应，酚/氯仿抽提后乙沉淀。
SephadexG－50层析分离后得5’
标记的DNA探针。
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注意事项：
(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感， 要求必需达到一定的纯度；脱磷酸后要 用SephadexG50层析除去小分子及离子。
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核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA 甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的 条件下通过碱基互补形成双链杂交体 的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术 是目前生物化学和分子生物学研究中 应用最广泛的技术之一，也是临床分 子检验的重要技术。
1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中，两 者之间的关系可以用经验公式表示：
Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
其中，69.3为无G＋C存在时的Tm值。
(G+C)%每增加1％，Tm约上升0.41oC。
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影响变性的因素：
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注意事项：
(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性 末端选择不同的标记核苷酸。 (2)选择适当的限制酶及α-32P-dNTP, 利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填 充活性，可以选择性地将DNA双链之中 一条链特异地标记。 (3)此方法不能直接用于3’凸出末端 DNA的标记。
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真 菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基 因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催 化产生的互补于mRNA的DNA链。
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探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
30μCi 加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
0.5mol/L Tris.Cl(pH7.02.)1mmol/L MDgTSTO(4二硫苏糖15醇m0m0o)μl/gL
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AATTC
CCTAGG
AATTC AATTC
EcoR I
BamH I
加入DNA聚合酶，dNTP(其中一种 为标记核苷酸)
CCTAGG
CCTAGG
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T4DNA聚合酶标记法
T4DNA聚合酶具有两种功能，5’→3’ 聚合活性 和3’→5’外切活性。当 反应体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合 酶主要表现为外切酶活性。利用这一 特性可产生5’凸出的DNA片段，然后 加入dNTP，其中之一为标记核苷酸， 在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成 出标记探针。
的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何 核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物 作用。将待标记的探针模板与随机引物一 起退火，合成标记探针。
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标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下 列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L 1μl
牛血清白蛋白
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2μl 1μl
2μl
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法：
(2)加入1单位Klenow聚合酶片段，室 温反应30min。 (3)加入12μl0.5mol/LEDTA以终止反 应。酚/氯仿抽提1次。 (4)Sephadex G－50柱层析或乙醇沉 淀法分离标记的DNA片段。
dATP、dGTP、dTTP
10x随机引物缓冲液 1μl
标记dCTP
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3μl
标记步骤
• 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在 蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一 毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴 中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA 转入上述离心管中
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P
P
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P
磷酸酶
T4多核苷酸激酶 ATP
P
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标记反应步骤：
(1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸
酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在
Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上
清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此
溶液可保存一个月以上。 (2)将DNA样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：
SephadexG－50层析脱盐后乙醇沉淀。取
脱盐后的脱5’磷酸DNA1～50pmol溶于少
量水中，然后加入下列试剂进行5’末端
标记：
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10x激酶缓冲液
10ul
γ-32P-ATP
5T04p多mo核l(苷15酸0u激Ci酶)
10～
加20U水至50ul，混匀，37oC保温1小
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10xCIP缓冲液
5μl
CIP缓冲液
适量
加水至
4置8μ37l oC30分钟。加入第二份CIP，继续保温
30分钟，即可脱去5’端磷酸基团。0.01U
的CIP，可脱去1pmol5’磷酸基团
(1.6μg4kb线性DNA的5’端数相当于
1pmol)。
10xCIP缓冲液 Tris.Cl(pH9.10)mmol/L
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随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单 链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是， 操作方法同上，但必须采用反转录酶。
• 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3 小时内使40％～60％以上甚至90％的标记 dNTP掺入到探针DNA链上
• 3、操作方便
DNase I
DNA Pol I,α-32P-dNTP
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标记步骤
• 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中
• 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀
10x切口平移缓冲液
0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L
1mmol/L 醇(DTT)
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成 的短探针。
• 优点： • 可根据需要人工合成相应的序列； • 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值
也有明显变化，特别适用于点突变的检测
• 杂交速度快特异性强 • 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂
交体不稳定
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探针的标记
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种
脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP 掺入新合成DNA链中使探针被标记。
带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双 链DNA均可作为切口平移法的模板。
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注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温
下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融 次数。
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标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl， 混匀
• 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀
注：以上操作均在冰浴中进行
• 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时
• 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
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单 链 DN A 探 针 的 标 记
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探针的标记
• 随机引物法 • 标记原理：随机引物是含有各种可能排列
MgCl2 ZnCl2 亚精胺
1mmol/L 10mmol/L
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(3)加入40μl H2O，10μl 10xSTE，
5μl 10％SDS。加热至68oC，15分钟。
10xSTE
100mmol/L
Tris.Cl(pH8.01)mol/L
NaCl
10mmol/L
E酚DT/A氯仿及氯仿各抽提两次除CIP，
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核酸分子杂交的种类和方法
核酸分子杂交的基本原理：DNA分子
由两条互补的单链形成的双螺旋结构。
维持结构稳定的力有三：1、两条链
间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆
积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。
变性：在理化因素作用下，双螺旋结
构间的氢键断裂，两条链解开形成单
链的过程。
• 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段， 混匀并离心，室温反应3小时以上
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标Байду номын сангаас步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L
Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L
NaCl
5mmol/L
EDTA
0.5%
SDS
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MgSO4 二硫苏糖
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500μg/ml 精品课件
牛血清白12
标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核 糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。
以下操作要在同位素工作室中有防护措 施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。
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3
核酸探针的标记
探针(probe)是指用放射性核素或其 它标记物标记的核酸片段。
放射性标记
标
记
生物素标记
物 非放射性标记 地高辛标记
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荧光素标记 4
探针的种类
• DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的 核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探 针又分为：
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探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以 是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。 其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交 反应效率极高
• 因不存在重复序列，因此特异性高
• 本底低 • 缺点：
17.07.2020
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探针的种类