EBER原位杂交过程

E B E R原位杂交过程

集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

预先准备的试剂胃酶浓缩液：将胃酶中加入4毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20℃）。

胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1NHCl用蒸馏水或去离子水10倍稀释，即成0.1NHCl溶液

PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween205滴，混匀后使用。

DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。也可按照上述比例，根据实际需要量配制。

胃酶消化工作液的配制

每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。

石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCl溶液100倍稀释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的

0.1NHCl溶液中，混匀后备用。

所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。

样品的收集和预处理

石蜡切片：

常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6微米的石蜡切片，56-60℃烤片2-16小时。处理好的切

片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟×2）。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。

酶处理（避免RNA酶污染，带手套操作）

将切片放置于37℃中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。

杂交程序（避免RNA酶污染，带手套操作）

杂交：

混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。湿盒中37℃孵育2小时，杂交过夜效果更好。

冲洗：

将切片浸入PBS缓冲液中10分钟，直到盖玻片自然脱落，用PBS缓冲液冲洗切片2分钟×3次，取出切片，擦干多余的缓冲液。

检测和显色程序

切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（试剂4），37℃孵育30分钟，PBS冲洗1分钟×3次（期间可摇动容器数次），用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×1次。

擦净切片边缘的水分，加入适量配制好的DAB工作液。显色5-15分钟，注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×3次后，即可进行封片或复染。

复染程序

可苏木素复染，染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，常规脱水、透明，封片。

无阳性表达可能原因：

1．塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，有些厂家提供的产品已达到RNase-free，可以直接使用，再次处理容易造成二次污染，得不偿失。但原则上国产塑料制品处理后方可使用。处理方法如下：

（1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）使DEPC 的终浓度为0.1%。注意：DEPC有致癌之嫌，须在通风柜中小心操作。（2）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

（3）在通风柜中37℃或室温下处理过夜。

（4）将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

（5）用合适的温度（80-90℃）烘烤至干燥，置于干净处备用。

2．玻璃和金属制品：实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤8小时或250℃烘烤3小时以上。另一种方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。

3．电泳槽：用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1轕C处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿，塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。

4．移液器：RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源，实验前最好取下它。

5．溶液：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液应用0.1轕C水于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034×105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液，可存几瓶新的，未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

6．研究人员：RNA酶广泛存在于人的皮肤上，最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离和分析RNA的材料和溶液时，以及在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。

一、?防止RNA酶污染的措施??

1.?所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。??

2.?塑料器皿可用0.1%?DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能

使用）。??

3.?有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%?H2O2?室温

10min，然后用0.1%?DEPC水冲洗，晾干。??

4.?配制的溶液应尽可能的用0.1%?DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的

DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。??

5.?操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。??

6.?设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。