乳酸脱氢酶活力测定(精)

丙酮酸+NADH+H+
pH7.4-7.8
LDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上清为组织提取液。LDH测定 方法很多，紫外分光光度法最为简便快速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸 收峰值，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶的含 量。
（二）LDH活力测定
实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 ℃ 水浴中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿， 在一只比色皿中加入0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分光光度计中，于340nm处调A 值为0；另一只比色皿用于测定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加 盖摇匀后测定A340nm，然后加入经稀释（20倍）的酶液10μl，立即计时，每隔0.5min测A340nm， 连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性部分，计算Δ A340nm/min减少值。
计时，准确记录每隔0.5min A340下降值。 3、NADH溶液应在临用前配制，如其纯度为75%，则应折合到100%，增加试剂的称量。加酶液前
NADH A340控制在0.8左右。
思考题 简述用紫外分光光度计测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。
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乳酸脱氢酶活力测定(精)
目的要求
（1）学习LDH活力测定原理； （2）测定动物肌肉组织提取液LDH活力及比活力。
原理
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）广泛存在于动物、植物及微生物细胞内，是糖 代谢酵解途径的关键酶之一，可催化如下反应：
Βιβλιοθήκη Baidu
乳酸 +NAD+
LDH
（三）蛋白质含量测定 将组织提取液稀释适当倍数（约1：20），取0.1ml按Folin-酚法测定蛋白质含量。
（四）数据处理
每毫升组织提取液中LDH活力单位：
Δ A340nm/min ×稀释倍数
LDH活力单位（U）/ml提取液=————————————————
酶液加入量（ 10μl ） ×10-3
提取液中 LDLHD总H活比力活单力位= LDH活力（U）/ml ×总体积
总LDH活力（U）
比活力（U/mg）=————————————
总蛋白含量（mg）
注意事项
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在-20℃ 低温冰箱中。 2、酶液的稀释度及加入量应控制A340/nm下降在0.1-0.2之间，以减少实验误差，加入酶液后应立即
试剂与器材
材料： 动物的肌肉、肝、心、肾等组织。 匀浆缓冲液： 10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾
缓冲液。
酶活力测定试剂：
（1）0.1mol/L pH7.5 磷酸缓冲液 (PB)100ml；
（2）NADH溶液：3.5mg纯NADH以 0.1mol/L pH7.5 PB 1ml稀释。
本实验反应液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中 340nm处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义为：在25 ℃ ，pH7.5条件 下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位，定量测定蛋白质 含量即可计算比活力（U/mg）。
（3）丙酮酸溶液：2.5mg丙酮酸钠，以以 0.1mol/L pH7.5 PB 29ml稀释。
试剂（2）（3）最好在临用前配制。
操作方法
（一）制备肌肉匀浆 （二）LDH活力测定 （三）蛋白质含量测定 （四）数据处理
（一）制备肌肉匀浆
取瘦猪肉（或兔肉）一块除去脂肪及筋膜等，称取20g，按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆 液倒至烧杯中，置4℃冰箱提取过夜，过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。