克隆技术
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第七章
细胞重组与克隆技术
7.1 概念 细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞 中分离出细胞器及其组分，然后在体外一 定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组 分进行重组，使其重新装配成为具有生物 活性的细胞或细胞器的技术。
意义： ① 细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核 质分离等技术相结合，为重新构成不同类型 的杂种细胞提供了可能。 ② 细胞重组技术结合基因转移技术可以人 为地使细胞表达新的性状的产生新的产物。
*1958年到1962年， 英国剑桥大学约翰. 格登（John Gurdon) 教授和麦金尼尔 （Machineer)利用 爪蟾上肠上皮细胞 核移植到未受精的 卵细胞中培育出可 育的非洲爪蟾。
1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽首次将小 鼠囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中， 培养发育到囊胚期，移入同步孕小鼠的子宫内 成功。 1983年，显微技术发展和完善促进了细胞核移 植技术的发展，1984年科学家维拉德森成功克 隆了一只小绵羊，开始家畜哺乳动物克隆，后 来先后克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的
胚胎，当时采用的是胚胎细胞克隆技术。
1997年，克隆羊多利诞生，这事第一个体细胞 克隆的高等哺乳动物。 我国动物细胞核移植开始于20世纪50年代，主 要是在两栖类和鱼类上进行，1990年后，我国 利用胚胎细胞核移植方法相继得到了克隆山羊、 克隆牛、小鼠等。
克隆动物研究
2003年4月19日，非洲大陆首个 克隆动物——小牛‚富特‛出生。 黑白相间的‚富特‛ 有4个‚妈 妈‛。‚富特‛的第一位‚母亲‛ 是一头编号为LMJC 865的母牛， 她鼎盛期日产78升牛奶的成绩曾 是南非奶牛最高的产奶纪录。从 她的耳部提取了一个体细胞，然 后将其中的DNA片段植入另一头 母牛取掉了DNA遗传基因的卵子 中。该胚胎在试管中培育了8天， 随后被植入第三头母牛的体内。 4月19日，研究人员对这头奶牛 进行了剖腹产手术，‚富特‛平 安降生。现在每天照顾、喂养 ‚富特‛的奶牛则是它的第四位 ‚母亲‛。
4、细胞器的分离 • 常用方法：研磨、超声振荡和低渗等将组 织制成匀浆再用沉降分离法实现分级分离。 • * 梯度沉降分离法 • * 等密度沉降分离法 • * 流式细胞仪分离法
5．胞质体、核体、微细胞的制备 （1）胞质体制备 玻璃盖片法、塑料片法、载玻片法、离心管 法、培养皿法、培养瓶法、悬液法 （2）核体制备 （3）微细胞制备 利用秋水仙素先将细胞阻断在染色体中期，然 后培养，再用细胞松弛素B处理得到。
克隆羊多利（Dolly）的诞生
1997年2月，英国Roslin研究所宣布克隆羊多 利（Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成 年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完 全相同的新生命个体。
是克隆技术的里程碑。
克隆一词变得家喻户晓
1、克隆定义：
克隆来源于英语‚clone”或‚cloning”的音译， 起源于希腊文‚Klone”，原意是用‚插条‛繁 殖。曾译为无性生殖或无性繁殖。 本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自 同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。
7.2 细胞重组方式：
（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种 胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞 核体：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜 的结构。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体 微细胞：只含有一部分基因组，外有薄层细胞质和完整质 膜的核质体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞 关键技术：细胞核质分离技术。
这头克隆的骡子是头小 公骡，由爱达荷大学和犹 他州州立大学的科学家共 同培育。为了克隆骡子， 研究者从一头名叫塔兹的 骡子身上提取了一些体细 胞，从细胞核内取出遗传 物质DNA，并将其植入从 母马体内提取的、经过剔 除遗传物质的卵细胞。科 学家们再将这种经过‚组 合‛的卵细胞培养到一定 阶段，然后放入母马的子 宫内孕育。经过数十次失 败的怀孕后，这头名叫 ‚爱达荷宝石‛的小骡子 终于在2003年5月4日诞生。
动物克隆
动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一个动物 细胞获得遗传背景相同的个体群的过程。
获得的个体群称为克隆动物（cloned animal） 主要通过‚核移植‛体现。
2、克隆的技术方法 1．细胞核移植 （1）细胞核移植技术：一种利用显微操作技术 将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核 成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得到的杂种 称核质杂种。 * 根据细胞核移植对象不同分为： 胚胎细胞核移植 体细胞核移植
（2）发展历史 1938年,第一个提出动物细胞核移植实验的 人是诺贝尔奖获得者，德国胚胎学家汉斯· 施 佩曼(Hans Speman)博士。 1952年，美国人罗伯特· 布里格斯（Robert Briggs)和T.J.金（T.J.King)建立了两栖类卵 细胞细胞核移植技术。他们将豹蛙发育到胚囊 期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个 可以摄食的豹蛙幼体。
显微操作法进行细胞核移植
2、细胞分离技术 （1）梯度沉降法 根据细胞大小不同 （2）等密度沉降分离法 根据细胞密度差异 （3）流式细胞仪分离法： 根据免疫荧光法测定脉冲数
3、细胞破碎方法： （1）超声波破碎法 声波冲击和震动产生的剪切力使细胞破碎 缺点：产热，大分子不易适用。 （2）反复冻融法 超低温冰箱或液氮冷冻后，37℃融化使细胞壁 破碎。 （3）化学裂解法 化学试剂使细胞膜裂解。 （4）高速组织捣碎法
6、细胞器拆合重组举例 叶绿体移植方法：将分离纯化的叶绿体与原 生质体共培养，通过细胞胞饮作用将叶绿体摄 入原生质体。 线粒体的分离主要采用差速离心分离法。移 植方法有术
克隆的定义 克隆的相关理论基础 克隆的技术方法 克隆技术的应用与意义 正确看待克隆技术 克隆动物的现状和发展趋势
相关技术
1、显微操作技术--细胞器拆合的必备技术
1911年，凯特（Kite）最早在细胞学研究中使用 该方法。 最早使用的核、质分离方法是用紫外线或激光将 核破坏，再用微玻璃针将其他细胞核吸入。后来， 将细胞融合技术与显微外科手术结合，用微吸管 将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再吸入等量 的灭活的病毒悬液，一并注入已去核的细胞中， 让其发生融合。
细胞重组与克隆技术
7.1 概念 细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞 中分离出细胞器及其组分，然后在体外一 定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组 分进行重组，使其重新装配成为具有生物 活性的细胞或细胞器的技术。
意义： ① 细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核 质分离等技术相结合，为重新构成不同类型 的杂种细胞提供了可能。 ② 细胞重组技术结合基因转移技术可以人 为地使细胞表达新的性状的产生新的产物。
*1958年到1962年， 英国剑桥大学约翰. 格登（John Gurdon) 教授和麦金尼尔 （Machineer)利用 爪蟾上肠上皮细胞 核移植到未受精的 卵细胞中培育出可 育的非洲爪蟾。
1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽首次将小 鼠囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中， 培养发育到囊胚期，移入同步孕小鼠的子宫内 成功。 1983年，显微技术发展和完善促进了细胞核移 植技术的发展，1984年科学家维拉德森成功克 隆了一只小绵羊，开始家畜哺乳动物克隆，后 来先后克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的
胚胎，当时采用的是胚胎细胞克隆技术。
1997年，克隆羊多利诞生，这事第一个体细胞 克隆的高等哺乳动物。 我国动物细胞核移植开始于20世纪50年代，主 要是在两栖类和鱼类上进行，1990年后，我国 利用胚胎细胞核移植方法相继得到了克隆山羊、 克隆牛、小鼠等。
克隆动物研究
2003年4月19日，非洲大陆首个 克隆动物——小牛‚富特‛出生。 黑白相间的‚富特‛ 有4个‚妈 妈‛。‚富特‛的第一位‚母亲‛ 是一头编号为LMJC 865的母牛， 她鼎盛期日产78升牛奶的成绩曾 是南非奶牛最高的产奶纪录。从 她的耳部提取了一个体细胞，然 后将其中的DNA片段植入另一头 母牛取掉了DNA遗传基因的卵子 中。该胚胎在试管中培育了8天， 随后被植入第三头母牛的体内。 4月19日，研究人员对这头奶牛 进行了剖腹产手术，‚富特‛平 安降生。现在每天照顾、喂养 ‚富特‛的奶牛则是它的第四位 ‚母亲‛。
4、细胞器的分离 • 常用方法：研磨、超声振荡和低渗等将组 织制成匀浆再用沉降分离法实现分级分离。 • * 梯度沉降分离法 • * 等密度沉降分离法 • * 流式细胞仪分离法
5．胞质体、核体、微细胞的制备 （1）胞质体制备 玻璃盖片法、塑料片法、载玻片法、离心管 法、培养皿法、培养瓶法、悬液法 （2）核体制备 （3）微细胞制备 利用秋水仙素先将细胞阻断在染色体中期，然 后培养，再用细胞松弛素B处理得到。
克隆羊多利（Dolly）的诞生
1997年2月，英国Roslin研究所宣布克隆羊多 利（Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成 年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完 全相同的新生命个体。
是克隆技术的里程碑。
克隆一词变得家喻户晓
1、克隆定义：
克隆来源于英语‚clone”或‚cloning”的音译， 起源于希腊文‚Klone”，原意是用‚插条‛繁 殖。曾译为无性生殖或无性繁殖。 本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自 同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。
7.2 细胞重组方式：
（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种 胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞 核体：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜 的结构。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体 微细胞：只含有一部分基因组，外有薄层细胞质和完整质 膜的核质体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞 关键技术：细胞核质分离技术。
这头克隆的骡子是头小 公骡，由爱达荷大学和犹 他州州立大学的科学家共 同培育。为了克隆骡子， 研究者从一头名叫塔兹的 骡子身上提取了一些体细 胞，从细胞核内取出遗传 物质DNA，并将其植入从 母马体内提取的、经过剔 除遗传物质的卵细胞。科 学家们再将这种经过‚组 合‛的卵细胞培养到一定 阶段，然后放入母马的子 宫内孕育。经过数十次失 败的怀孕后，这头名叫 ‚爱达荷宝石‛的小骡子 终于在2003年5月4日诞生。
动物克隆
动物克隆是指通过无性繁殖的手段，从一个动物 细胞获得遗传背景相同的个体群的过程。
获得的个体群称为克隆动物（cloned animal） 主要通过‚核移植‛体现。
2、克隆的技术方法 1．细胞核移植 （1）细胞核移植技术：一种利用显微操作技术 将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核 成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得到的杂种 称核质杂种。 * 根据细胞核移植对象不同分为： 胚胎细胞核移植 体细胞核移植
（2）发展历史 1938年,第一个提出动物细胞核移植实验的 人是诺贝尔奖获得者，德国胚胎学家汉斯· 施 佩曼(Hans Speman)博士。 1952年，美国人罗伯特· 布里格斯（Robert Briggs)和T.J.金（T.J.King)建立了两栖类卵 细胞细胞核移植技术。他们将豹蛙发育到胚囊 期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个 可以摄食的豹蛙幼体。
显微操作法进行细胞核移植
2、细胞分离技术 （1）梯度沉降法 根据细胞大小不同 （2）等密度沉降分离法 根据细胞密度差异 （3）流式细胞仪分离法： 根据免疫荧光法测定脉冲数
3、细胞破碎方法： （1）超声波破碎法 声波冲击和震动产生的剪切力使细胞破碎 缺点：产热，大分子不易适用。 （2）反复冻融法 超低温冰箱或液氮冷冻后，37℃融化使细胞壁 破碎。 （3）化学裂解法 化学试剂使细胞膜裂解。 （4）高速组织捣碎法
6、细胞器拆合重组举例 叶绿体移植方法：将分离纯化的叶绿体与原 生质体共培养，通过细胞胞饮作用将叶绿体摄 入原生质体。 线粒体的分离主要采用差速离心分离法。移 植方法有术
克隆的定义 克隆的相关理论基础 克隆的技术方法 克隆技术的应用与意义 正确看待克隆技术 克隆动物的现状和发展趋势
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1、显微操作技术--细胞器拆合的必备技术
1911年，凯特（Kite）最早在细胞学研究中使用 该方法。 最早使用的核、质分离方法是用紫外线或激光将 核破坏，再用微玻璃针将其他细胞核吸入。后来， 将细胞融合技术与显微外科手术结合，用微吸管 将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再吸入等量 的灭活的病毒悬液，一并注入已去核的细胞中， 让其发生融合。