无菌试验方法和验证
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
无菌检查法及其验证
供试品溶液的制备
④非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或其
它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。 用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3 次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。 培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。 其他类供试品： ⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 ⑥无菌气（喷）雾剂供试品 ⑦装有药物的注射器供试品 ⑧具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品
❖ 若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品不符合规定。
❖ 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。 ❖ 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果
无效：
15－30
❖ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结 果不符合无菌检查法的要求；
❖ 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素；
❖ 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml，以避免 滤膜上的微生物受损伤。
❖ 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般薄膜 过滤器。滤膜孔径不大于0.45μm，直径约为50mm。
15－21
供试品的无菌检 查法
❖ 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数量 ❖ 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照；
❖试验同时应做空白对照
15－16
培养基说明
❖ 无菌检验培养基所能支持生长的微生物是有限的。 ❖ 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的生长要求，如：营
养、温度和氧等。 ❖ 无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，选择了支
持那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物的营养 的培养基。
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌检验方法验证方案
无菌检验方法验证方案1.引言无菌检验是对物品或产品进行微生物污染检测的一种方法。
验证无菌检验方法的准确性和可靠性是确保检验结果准确的关键因素。
本方案旨在提供一种有效的无菌检验方法验证实施方案。
2.目的验证无菌检验方法的准确性和可靠性。
3.系统概述本方案包括以下主要步骤：-设计验证实验方案-准备验证试验样品和无菌试验介质-运行验证试验-分析结果并评估方法的准确性和可靠性-编写验证报告4.设计验证实验方案根据实际情况，设计验证实验方案，包括验证试验的样品数量、样品类型、试验方法和实验条件等。
根据实际情况，选择合适的无菌检验方法进行验证。
5.准备验证试验样品和无菌试验介质根据验证实验方案，准备验证试验所需的样品和无菌试验介质。
确保样品和介质的质量符合要求，并严格遵守洁净操作程序，防止试验过程中的污染。
6.运行验证试验按照验证实验方案，进行验证试验。
严格按照无菌检验方法的要求进行操作，确保试验过程的准确性和可靠性。
对样品和无菌试验介质进行适当的控制，以确保试验结果的可靠性。
7.分析结果并评估方法的准确性和可靠性根据验证试验的结果，进行数据分析。
对验证试验过程中的任何问题进行评估，并判断无菌检验方法的准确性和可靠性是否满足要求。
如果发现问题，需要进行适当的调整，并重新运行验证试验。
8.编写验证报告根据验证试验结果，编写验证报告。
报告应包括验证试验的目的、方法、结果和结论等。
报告应清晰、准确地描述验证试验过程和结果，并提出相应的建议。
9.结论通过验证实验方案的实施，可以评估无菌检验方法的准确性和可靠性。
如果验证结果表明方法可靠，可以继续使用该方法进行无菌检验。
如果验证结果不满足要求，需要对方法进行修订或选择其他合适的方法。
总之，无菌检验方法的验证是确保检验结果准确的重要步骤。
通过设计合理的验证实验方案、准备样品和无菌试验介质、运行验证试验、分析结果并评估方法的准确性和可靠性，可以有效地验证无菌检验方法的准确性和可靠性，并提供一份详尽的验证报告。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
无菌检验技术—无菌检查方法验证
• 3.3无菌检查的范围 • 凡进入人体无菌部位(人体的血液循环பைடு நூலகம்统、肌肉、皮下组织)或接触创
伤、溃疡面等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、无菌器具均应 进行无菌检查。对于规定灭菌的药物，包括注射剂及用于体腔、严重烧 伤、溃疡及眼科用药等，必须严格无菌，即在规定检验量的供检品中不 得检出活微生物。
任务3 无菌检验方法验证 知识点3 无菌检查方法
• 3 无菌检查方法 • 3.1无菌检查法概念 • 无菌检查法是指检查《中国药典》要求应无菌的药品、医疗器具、原料、 辅料及其他要求无菌的品种是否染有活菌的一种方法（供试品符合无菌检查 法的规定，仅进表明了供试品在该检查条件下未发现被微生物污染）。 • 为了保证药品的卫生质量，保证药品在临床上的安全使用和保障人民的健 康，《中国药典》规定：注射用药、灭菌的外用制剂等均需做无菌检查。
• 的制剂。心脏瓣膜以及固定金属板和有机器材等。
• (3)冲洗剂，即用于冲洗开放性伤口或腔体的冲洗剂。
• (4)眼用制剂。
• (5)用于烧伤、创伤或溃疡的制剂。包括：用于烧伤或严重创伤的局部用 散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂；用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂和喷 雾剂等。
• (6)用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂或洗耳剂。 • (7)用于手术或创伤的鼻用制剂。 • (8)用于止血并可被组织吸收的制剂。如明胶发泡剂、凝血酶等，用于止
• 3.2验证目的 • 确认所用的无菌检查方法适用于“所有无菌产品”的无菌检查。 • 确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性以及检查方法的完整 性。 • 通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即无菌产品的生产全过程 进行质量监控。 • 3.3验证范围 • “所有无菌产品”的无菌检查。
• 3.4验证条件 • 3.4.1验证用菌株 • 金黄色葡萄球菌 • 菌种传代次数铜绿假单胞菌 • 枯草芽孢杆菌 • 生孢梭菌 • 白色念珠菌
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
无菌检验方法验证报告
文件制修订记录1. 概述：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
本公司的无菌检查只是针对于灭菌注射用水的无菌检查。
灭菌注射用水灭菌工艺采用121℃30min过度杀菌法，按照2005年版《中国药典》的规定，注射剂的无菌检查应采用薄膜过滤法。
制定的《无菌检查法标准操作规程》（SOP4.14.038-B）应经过验证后，才能批准使用。
2. 验证目的：验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。
即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。
3. 验证范围：适用于灭菌注射用水无菌检查法的验证。
4. 验证人员及职责质量部负责该验证方案的起草及组织实施；验证小组负责验证方案的审批；质量部参与验证的实施及监督。
5. 文件准备和培训检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
6.1. 无菌检查室空气净化系统已经过验证并合格，仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.2. 供试品：3批，批号：批号：批号：6.3. 培养基及试剂：6.3.1. 试剂试液：氯化钠:临用前配成0.9%浓度的溶液，配制记录见附件1。
冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液，配制记录见附件2。
6.3.2. 培养基硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：批号：改良马丁培养基生产厂家：批号：营养肉汤培养基生产厂家：批号：改良马丁琼脂培养基生产厂家：批号：蛋白胨生产厂家：批号：培养基配制记录见附件3。
6.4. 验证用菌株：金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】生孢梭菌【CMCC（B）64941】白色念珠菌【CMCC（F）98001】黑曲霉【CMCC（F）98003】购自：各验证用菌种传代记录见附件4。
6.5. 无菌检验仪器及相关设备：压力蒸汽灭菌器型号：生产厂家：校验日期：有效期：生化培养箱（细菌培养）型号：生产厂家：校验日期：有效期：生化培养箱（霉菌培养）型号：生产厂家：校验日期：有效期：7. 验证内容：7.1. 培养基无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支，培养14天，应无菌生长。
4无菌检验方法验证
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无菌检验方法验证
1.ONE
开展验证的思路和程序
首先了解供试品是否具有抑菌性，抑什么菌
2.TWO
考虑和选择出适当的方法已消除或减低供试品的抑菌性
3.three 4.four
用实验证明你所用的方法已消除抑菌性——能使人工加 入的各种菌生长良好。
将所作实验记录在案——即为确认该供试品在该检验量
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
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无菌检验方法验证
方法验证试验 当建立产品的无菌检查方法时，应进行
六、验证结论。
七、【检查】项下【无菌】或【微生物限度】具体方法确定。
八、实验员签名、验证报告批准人签名。
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无菌检验阳性结果调查
无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法要求
回顾无菌测试过程，发现有可能引起微生物污染的 因素
阴性对照有菌生长
稀释：—— 验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释 倍数。
离心：—— 验证所用转速、时间和微生物的分YO布UR情SIT况E H。ERE
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3、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌 方法一： 可通过查阅临床药物实验手册、文献资料 （特别是杂志“Drug”，每一种新药上市，都有专 门的综述）、申报资料中的药效学资料，关注其对不 同细菌的MIC情况、参考已经验证过的品种、抗菌 药物可根据抗菌谱确定其敏感菌、中成药如果抗菌谱 不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验等方 法。也可直接通过验证实验确定之。
无菌试验方法验证方案
无菌试验方法验证方案一、方案目的二、方案方法1.文献调研：通过查阅相关文献，了解无菌试验方法的原理、步骤和要求，确保验证方案与国际标准和法规相符合。
2.试验设计：根据文献调研结果，设计验证试验，包括试验目标、样品选择、试验参数和试验步骤等。
3.实验操作：按照试验设计的要求，进行实验操作。
包括准备无菌工作区、取样品、进行稀释等。
4.正负对照：设立正负对照组，以比较验证试验的准确性和可靠性。
正对照组应为已知无菌品，而负对照组为已知含有微生物的样品。
5.数据分析：对试验结果进行统计和分析，验证试验方法的灵敏度、特异性和重复性等指标。
6.结果判读：根据数据分析的结果，对试验方法的有效性进行判读，判断试验方法是否合格，进而确定是否需要对试验方法进行进一步优化或修改。
三、方案步骤以下是无菌试验方法验证的具体步骤：1.确定试验方法：根据国际标准和法规，选择适用的试验方法。
例如，可以选择滴定法、过滤法、涂布法等。
2.设计验证试验：根据试验方法的原理和要求，设计合适的试验方案。
包括样品的选择、试验参数的确定，以及试验步骤的规定等。
3.准备验证样品：准备无菌产品及相关样品，包括正对照组和负对照组。
正对照组为已知无菌产品，负对照组为已知微生物污染的样品。
4.实验操作：按照试验方案的要求，进行实验操作。
包括取样品、进行稀释、进行培养等。
5.结果分析：对试验结果进行统计和分析。
比较正对照组和负对照组的结果，计算验证试验的灵敏度、特异度、准确性等指标。
6.结果判读：根据结果分析的结果，判读试验方法的有效性。
如果验证试验结果与预期结果一致，并且达到规定的标准，则认为试验方法合格。
7.结果报告：将验证试验的结果进行记录和总结，并撰写验证报告。
报告中应包括试验方法的详细描述、试验步骤、结果数据和分析等内容。
四、方案要点1.样品选择：选择适当的样品进行验证，确保验证结果能够准确地反映真实情况。
2.试验参数：准确地确定试验方法的参数，包括培养时间、培养条件、培养基成分等。
无菌检验及方法验证
培养基
• 中国药典: 改良马丁和FTM • 美国药典: TSB 和FTM • 购买的RTU培养基/实验室配制的培养基 • 按照相应的SOP编制培养基的批号 • 培养基质量控制（pH，无菌性，灵敏度实验） • 制定有效期 • FTM培养结束后培养基氧化层（粉红色）不应超过培养基深度
1/2。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的 1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分 钟），迅速冷却，只限加热一次
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 根据药典方法选择阳性菌种(G-,G+,酵母菌,真菌, 环境中分离 得到的菌株) – 购买的RTU培养基每批要进行灵敏度检查 – 将小于100 CFU的阳性菌加入培养基内,计数 – 细菌培养不超过3天,真菌培养不超过5天 – 空白对照无菌生长,加菌的培养基生长良好 – 加入添加剂的培养基须重新进行灵敏度检查 – 菌种制备,保存和培养的SOP – 对新开的菌种冻干管需要对菌种进行鉴定,菌种传代不超过5 代
培养基（续）
• 灵敏度检查 – 购买药典推荐的菌种 FTM：枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，生 孢梭菌 TSB：白色念珠球菌，黑曲霉菌 --至少包含一种环境菌
• 培养基无菌性检查 培养基应在适当的温度下培养14天以检测其无菌性,每批随机抽取 5瓶
-培养基灵敏度检查可以和培养基无菌性检查、无菌检查同步进行
无菌实验
• 取样Sampling • 检测方法Test methodology • 培养基Media • 培养时间Incubation period • 阴性对照Negative test controls • 阳性对照Positive test controls
中国药典2020版无菌检查法
中国药典2020版无菌检查法
无菌检查是药典中用于评估药品无菌性的一种方法。
以下是中国药典2020版中关于无菌检查的要求：
1. 无菌试验方法：根据药物性质和使用的目的，可以采用常规法、膜过滤法、波动消耗法等无菌试验方法。
2. 试剂和材料：无菌试验需要准备无菌培养基、无菌器皿（如培养瓶、试管、平板等）、无菌针头、移液器、层流罩等试剂和设备。
3. 检测操作：首先要进行无菌状态的确认，包括无菌器具、培养基和环境的无菌检查。
然后将样品加入培养基中，通过适当的方法进行培养，如摇瓶培养、倾斜培养等。
培养时间和温度要根据不同试验要求来设定。
4. 结果判定：检查培养基是否出现细菌、真菌或其它微生物的生长。
根据结果进行判定，如果培养基无细菌生长，可认为样品为无菌。
如果有生长，则认为样品不符合无菌要求。
需要注意的是，无菌检查方法的选择和具体实施要根据不同药品的特点和要求来确定，且检测结果应符合相关法规和规范的要求。
无菌试验分析报告范文
无菌试验分析报告范文一、实验目的无菌试验是为了确定某一物品是否符合无菌条件，即是否存在微生物污染。
本次实验旨在验证样品是否符合无菌要求，以保证其在医药行业的安全使用。
二、实验原理实验基于无菌技术，通过将待检样品与无菌培养基接触培养，观察是否有生长菌落出现来判断样品是否被微生物污染。
实验中使用的培养基为营养丰富的琼脂，可提供微生物生长所需营养物质。
三、实验过程1. 准备工作：消毒台面，戴上无菌手套，燃烧酒精灯。
2. 取样检测：使用无菌工具，将待检样品取出。
3. 涂抹法：将待检样品均匀涂抹于琼脂培养基表面，避免厚度不均。
4. 培养：将涂抹好的琼脂培养基培养皿放入恒温培养箱，以适宜的温度和时间进行培养。
5. 结果观察：培养结束后，观察培养皿上是否有生长菌落。
四、实验数据及结果分析经过培养结束后观察发现，检测样品所涂抹的琼脂培养基表面上无任何生长菌落的出现。
根据无菌试验的原理，样品没有出现菌落生长，说明未被微生物污染，符合无菌要求。
五、实验结论经过无菌试验，检测样品未出现菌落生长，符合无菌条件，可放心使用。
六、实验中遇到的问题及解决方法在实验过程中，由于琼脂培养基的涂抹量不均匀，导致实验结果可能不准确。
应注意仔细均匀涂抹样品，以确保实验结果的准确性。
七、改进方案为提高实验效果，建议在培养过程中，加入抗生素等抑菌剂，以防止培养过程中的外部微生物污染。
八、安全注意事项1. 在操作过程中戴上无菌手套，保持台面清洁。
2. 使用酒精灯时要小心火源，以免发生意外。
3. 处理样品时需注意避免扩散，以免造成污染。
结语通过本次实验，我们验证了样品的无菌质量，结果表明样品符合无菌要求，可安全使用。
无菌试验是确保产品和实验室环境安全的重要步骤，能够有效预防微生物污染，保证产品质量。
在今后的工作中，我们将进一步完善实验方法，提高实验的准确性和可靠性，为医药行业的无菌质量控制提供更高水平的支持。
7、无菌验证方案
无菌验证方案罐号：编码：批准人：会签人：一、验证目的: 验证罐体设备无菌情况；二、验证要求:1、必须针对整个设备系统的严密性进行检查；2、采用培养基模拟试验进行无菌验证；三、质量标准1、设备系统方面没有跑、冒、滴、漏；2、培养基模拟试验运行连续两批处于无菌状态；三、验证方法（一）系统严密性检查：罐体、管线采用压缩空气（压力约0.12-0.15MPa）保压；用肥皂水喷淋焊点、接点，确认焊点、接点有无渗漏。
（二）培养基模拟试验：若试验失败则重新进行罐体、管道清洁、消毒后进行培养基试验。
第一次采用无菌培养基，第二次采用Q10种子培养基（配方减半）1、工艺控制点2.培养基配方3、无菌监控方法：每4小时取样一次；肉汤直接从罐上取样；平板在超净工作台上进行无菌操作取样；实样镜检采用美兰染色方法。
4、运行方式：单罐批运行60h以上无菌正常视为罐体无菌试验成功。
.四、时间进度表2007年11月11日开始；五、组织实施部门生产部发酵车间组织实施；具体：维修组负责设备方面的维护；消毒组负责罐体方面的打压试漏、空气过滤器的灭菌、培养基的灭菌；值班组负责工艺参数的控制；种子组负责取样以及无菌检测、监控；工艺组负责结果的判定；统计员负责验证原始材料的整理、汇总；化验组负责离线参数的检测。
无菌验证报告一、验证项目名称：发酵设备无菌验证；二、验证对象：微生物发酵培养罐、补料罐；三、验证日期：2007年12月5日四、验证人员：生产部发酵车间全体员工。
五、验证结果：1、验证方案实施情况：主要陈述验证方案规定的各项指标或指标的误差范围的事项情况。
2、数据综述：综述试验过程中所得到的各项关键性数据。
一般情况下原始记录不包括在报告中，但可附在验证报告之后，或存档于验证资料档案中。
3、偏差情况分析：验证过程中的特殊情况或异常情况应在报告中加以说明。
4、图表：必要的图表有利分析评价。
六、最终结果1、通过打压试漏，罐体、管线没有跑、冒、滴、漏。
无菌检查法检技术与方法
无菌检查法检技术与方法
无菌检查法是一种常用的微生物检测方法，用于确定物体或环境是否存在可生长的微生物。
以下是无菌检查法的一般技术与方法：
1. 准备工作：在进行无菌检查之前，需要准备无菌培养基、培养器具（如平皿、试管等）以及所需的无菌工具（如火焰灭菌器、无菌棉签等）。
2. 灭菌操作：使用火焰灭菌器将培养器具和工具进行灭菌处理，以确保无菌状态。
3. 取样：将待检物体或环境样品采集到无菌容器中，避免外界微生物的污染。
4. 培养基接种：将采集到的样品通过无菌棉签或无菌工具划取，均匀涂布于无菌培养基的表面。
5. 培养：将涂布好的培养基平皿或试管密封好，放入恒温培养箱中，以适当的温度和时间进行培养。
6. 观察和计数：在培养一定时间后，观察培养基表面是否有生长的微生物，如菌落的形成。
可以使用显微镜观察细菌的形态。
7. 结果分析：根据观察到的菌落形态、颜色、大小等特征，结合相关标准和文献，确定是否存在可生长的微生物。
需要注意的是，无菌检查法的具体步骤和条件可能因检测对象的不同而有所变化。
同时，为了确保检测结果的准确性，无菌
操作、培养条件和培养基的选择都至关重要。
在进行无菌检查时，应严格遵守相关的操作规范和实验室安全要求。
无菌挑战性验证方案
无菌挑战性验证方案1、试验目的：确认XX生产线在安装调试后是否达到无菌生产的要求。
2、可接受质量限（AQL）：根据生产产品的特性可接受质量限（AQL）水平确认为0.1（%）。
3、试验产品：每次试验产品采用花生牛奶，配置量2000L。
4、试验步骤：试验前所有的设备、管道、罐要预先进行钝化。
对车间设备、地面和环境卫生进行彻底清理，并用二氧化氯消毒剂对车间空间、地面进行喷雾消毒。
第一天：设备、管路经过CIP清洗后，按正常生产程序进行生产，取开机运行正常后连续的2400包，按出包顺序进行取样，并给予编号，保温后进行检测。
生产结束后进行CIP清洗。
清洗后等待第二天的生产。
第二天：按正常生产程序进行生产，（开机前不要再进行任何内部清洗），取开机运行正常后连续的2400包，按出包顺序进行取样，并给予编号，保温后进行检测。
生产结束后进行CIP清洗。
清洗后等待下一次生产。
第三天：对设备、管路不做任何内部清洗，设备不生产。
第四天：按正常生产程序进行生产，（开机前不要再进行任何内部清洗），取开机运行正常后连续的2400包，按出包顺序进行取样，并给予编号，保温后进行检测。
5、一次无菌试验所要验证的情况：（一般性要求）第一、二天要验证系统的密闭性。
第三天空一天，要验证CIP的清洗效果。
（如果有清洗死角，可以使微生物有时间充分繁殖）。
6、无菌实验条件：无菌试验取样数：设备无菌性验证以纯牛奶进行实验，每次取样2300~2500包。
完成一次无菌试验共进行三个批次的取样。
无菌试验保温条件：采用纯牛奶系列产品进行无菌试验，温度应控制在30℃--35℃，保温7天后进行商业无菌检测。
商业无菌的检验方法：每批样品经保温试验未胀、酸包或泄露；保温后开包，经感官检查、PH值测定或接种培养，确认无微生物繁殖现象，则认为为商业无菌。
坏包的定义：产品在密封良好的情况下，由微生物原因引起的不符合质量标准的产品。
依据条件：据统计研究：将超高温奶的样品在30℃-35℃的条件下保存3天后，有50%的坏包能暴露出来；保存5天后，有75%的坏包能暴露出来；保存7天后，有90%的坏包能暴露出来。
无菌检查方法验证方案
无菌检查方法验证方案无菌检查是用来验证产品的无菌性的方法。
无菌性是指产品中不存在可繁殖的微生物。
无菌检查的目的是确保产品的安全性和质量，避免由于微生物污染而引起的感染或降低产品的有效性。
1.检测方法的选择：根据产品的特性和要求，选择合适的无菌检测方法。
常用的无菌检测方法包括微生物限度试验、膜过滤法、直接刨片法和填充法等。
2.样品准备：根据产品的特性和要求，合理选择样品的采集方法和数量。
样品的采集应在无菌条件下进行，以避免外部微生物的污染。
样品的存储和运输也需要符合无菌条件。
3.控制样品：准备一批已知无菌的样品作为正对照，以验证无菌检测方法的准确性和灵敏度。
正对照的准备应在无菌条件下进行，并进行相关记录。
4.负对照：准备一批已知含有可繁殖的微生物的样品作为负对照，以验证无菌检测方法的特异性和无菌性。
5.实验操作：根据选定的无菌检测方法，进行实验操作。
实验操作应在无菌条件下进行，包括无菌操作台、无菌培养基和无菌器具的使用。
所有操作人员都应接受相关的培训和认证。
6.试验结果的解释和判定：根据实验结果，判断样品是否无菌，并根据相应的标准和规范进行判定。
试验结果的解释和判定应由经过培训和认证的人员进行。
7.系统的记录和存档：对于每一次无菌检测，应记录实验过程、实验结果和相关的数据。
实验记录应具备可追溯性，便于审核和查找。
所有记录和相关数据应进行适当的存档，以备将来参考。
8.系统的验证：根据无菌检测方法验证方案的内容和要求，对整个无菌检测系统进行验证，包括设备、物料和人员。
验证应由专业的第三方机构进行，确保验证结果的客观性和可靠性。
验证结果和报告应进行适当的存档，以供将来参考。
以上就是一个完整的无菌检查方法验证方案。
通过合理的无菌检查方法验证方案的制定和实施，可以确保无菌检测的准确性和可靠性，保证产品的质量和安全性。
无菌验证方案
1.对无菌操作人员进行定期培训，提高其操作技能和意识。
2.加强生产过程监控，确保无菌操作持续合规。
3.对验证过程中发现的问题，及时整改并跟踪验证效果。
九、方案审批
本方案经相关部门审核、批准后实施。十、附件1. Nhomakorabea菌验证计划
2.无菌试验操作规程
3.模拟试验操作规程
（注：本方案仅作为无菌验证的指导性文件，具体实施过程中需结合实际情况进行调整。）
十、附件
1.无菌验证计划
2.无菌试验操作规程
3.模拟试验操作规程
（注：本方案仅作为无菌验证的指导性文件，具体实施过程中需结合实际情况进行调整。）
第2篇
无菌验证方案
一、前言
为确保产品质量，满足无菌产品生产要求，依据《药品生产质量管理规范》（GMP）及相关法规，特制定本无菌验证方案。本方案旨在对无菌生产过程进行严格监控，确保产品在整个生产过程中达到无菌标准。
无菌验证方案
第1篇
无菌验证方案
一、项目背景
为确保产品在生产过程中达到无菌要求，保障产品质量和消费者安全，根据《药品生产质量管理规范》（GMP）及相关法律法规，特制定本无菌验证方案。
二、目标
1.确保生产过程符合无菌要求。
2.确保验证过程合规、有效。
3.提高产品质量，降低生产风险。
三、验证范围
1.验证产品：本次验证针对所有无菌产品。
2.现场检查：对无菌生产现场进行实地检查，评估无菌操作环节的风险。
3.无菌试验：对关键工艺环节进行无菌试验，以验证产品无菌性。
4.模拟试验：模拟无菌操作过程，验证操作规程的可行性。
五、验证流程
1.准备阶段：
a.成立无菌验证小组，明确各成员职责。
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培养基：
培养基的贮藏
固体培养基灭菌后只允许再融化一次，以避免培养 基过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。一 般采用水浴加热或流通蒸汽的方式再融化培养基， 如使用微波炉，应避免过度加热和水分流失。融化 后的培养基应置45～50℃的水浴中保温，时间不 得超过8小时。 倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分， 避免容器外壁的水滴进入培养基中造成污染。 使用过的培养基应按照国家污染废物处理相关规定 进行
• 代的定义：活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中 培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。
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菌种：
• 实验室应建立文件化的程序管理菌种（从标准菌株到工作 菌株）。 通常该程序包括：
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培养基： 培养基的制备 • 培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。应对高压 灭菌器的蒸汽循环系统进行验证，确保在一定装载方 式下的正常热分布。 如培养基使用不适当的加热和灭菌条件，可能会引起 颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的变化。 温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基过热，过 度灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基的促 生长能力。
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实验室的布局和运行：
毒剂的种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。 实验室的操作应避免交叉污染。 如需对培养物进一步分析，如再培养、染色、微 生物签定或其他确定试验应在实验室的活菌操作 区进行。任何出现微生物生长的培养物不得在实 验室无菌区域内打开。不能再实验室的活菌操作 区域或邻近区域进行抽样，以防止在取样过程中 使样品受到微生物的污染，以减少假阳性的结果 出现。 应建立实验室生物安全的应急控制预案。 应建立微生物实验废弃物的处理规程。
• 人员培训应覆盖仪器设备操作、微生物检 验技术和实验室生物安全等；
实验人员应依据所在岗位和职责接受相应 的岗前培训，包括：仪器设备操作、微生 物检验技术和实验室生物安全等方面的培 训，检验人员必须熟悉相关检测方法、程 序、检测目的和结果评价，经考核后方可 上岗。
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培养基：
质量控制试验
• 实验室应制订培养基质量控制程序。 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。 培养基质量控制的项目有：pH值、适用性检查 和定期的稳定性检查以确定有效期。 当培养基的配制和灭菌程序等均已验证，则同 一批次的脱水培养基的适用性检查试验可只进 行一次。
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员 培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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实验室的布局和运行：
实验室布局的原则：最大程度防止微生物的 污染，防止检验过程对环境和人员造成危害。
• 培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基 可采用薄膜过滤除菌。 通常按照生产商提供或使用经过验证的参数进行培 养基的灭菌。商品化的培养基必须附有灭菌方法。 对于一些热敏感的培养基不能使用湿热灭菌技术。
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培养基： 培养基的制备
应按处方配制培养基，也可使用市售的脱 水培养基。
脱水培养基应附有处方和使用说明，按照 使用说明配置培养基，不得使用结块或变色的 脱水培养基。
脱水培养基或单独配方组分应在适当的条 件下储存，所有的容器应密封。
商品化的成品培养基除了应附有处方和使 用说明外，还应注明有效期、储存条件、适用 性检查试验的菌和用途。
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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菌种：
由于菌种可能是微生物试验中最敏感的影响因素之一，因 此实验室应该详细规定菌种的处理和保藏方法，以尽可能 的减少菌种污染和生长特性的改变。
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设备：
实验室的仪器设备完成相应的验证和校验并 形成相应的操作、维护和校验的标准操作规程后 方可正式使用，使用要有记录。
微生物实验室所用的仪器设备应定期校准， 并记录。校准的周期和校验的内容根据仪器的类 型和设备在实验室产生数据的重要性而定。
培养箱、冰箱等重要设备应确保状态正常， 并有措施保证其运行状态正常和受控。工作的连 续性。
实验室应具备：满足无菌检查、微生物限 度检查和无菌采样等活动的独立设置的洁净室 （区）或隔离系统；配套的细菌（真菌）实验 室、培养室、准备区、样品接受和贮藏区、标 准菌株贮藏区、污染物处理区和文档处理区等 辅助实验室；上述区域应明确标识。
应建立洁净区的使用、维护、验证等活动 的标准操作规程。操作规程中应详细描述对进 出洁净区域的人和物的要求、洁净度检测的频 率、消毒和清洁维护的方法、尘埃粒子的标准 、浮游菌和沉降菌的标准、消
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培养基： 培养基的贮藏 • 自配培养基应标记名称、批号、配制日期等信 息，商品化的成品培养基应标记名称、批号、 生产日期和失效期等信息。 自制的培养基应再验证的条件下贮藏； 商品化的成品培养基应按照说明书上的要求进 行贮藏，以最大限度的减少水份的流失。
我们将按照以下几部分对微生物实验室进 行介绍：
人员 培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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人员：
• 人员的专业背景；
从事药品微生物试验工作的人员应具备微 生物学或相近专业只是的教育背景。
标准菌种的申购记录； 从标准菌株到工作菌株操作及记录； 菌种必须定期转种传代，并作纯度、特性等检查项目； 每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数 菌种生长的培养基和培养条件； 菌种保藏的位置和条件。
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ห้องสมุดไป่ตู้
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人员：
• 应通过内部质量控制、能力验证或使用标 准菌株等方法评估检验人员的能力。 如有必要（如一段时间内由于人员的原因 偏差重复出现或显示某种不良趋势），需 要对其进行再培训并重新评估。当使用一 种非经常使用的方法或技术时，有必要再 检测前确定微生物检测人员的操作技能（ 并不意味着熟练的人员就不需要进行再培 训或者能力再评估）。 所有人员的培训、考核内容和结果均应记 录归档。
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员 培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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无菌实验方法验证
2010.10 王彦忠
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本部分主要从以下四个方面对无菌实验方法验证 进行介绍：
1. 微生物实验室的要求； 2. 无菌分析方法的验证； 3. 无菌检查的检验数量和检验量； 4. 无菌检查的注意事项和GMP检查的重点；
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我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：
人员 培养基
菌种
实验室的布 设备 局和运行
文件
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培养基： 质量控制试验
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批 培养基均要进行适用性检查试验，试验菌种除 根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也 须增加从环境及产品中分离的常见污染菌株。
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一、微生物实验室的要求
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