液相色谱实例分析

液相色谱常见问题
压力异常（偏高、波动）
漏液
保留时间漂移
基线问题（漂移、噪声）
峰形异常
压力
压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注 压力的变化。
保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。 不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力 也是不同的。
记下仪器正常状态时，在固定条件下（流动相、 流速、温度等）的压力显示值。
高效液相色谱应用实例
对有机酸具有高选择性和高灵敏度
柱后pH调节电导检测
有机酸分析系统流程图
1 3
1、2 泵 3 进样器 柱温箱
9 8 2 4
4
5
6 7
电导检测器
数据处理机 混合室
7
10 6 5
8
9 10
柱子
流动相 缓冲液
分析条件
• 分离条件 色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D．×300mmL.) 1个或2个分析柱连接 保护柱 SCR-102H (6mmI.D.×50mmL.) 流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液 流量 ：0.8mL/min 温度 ：40℃或45℃ • 检测条件 缓冲液：20mM Bis-tris 水溶液 含 5mM p-甲苯亚磺酸和100μＭ EDTA 流量 ：0.8mL/min 检测器：电导检测器 polarity;+
氨基酸分析系统
NH2 R C COOH
H
氨基酸衍生化方法
• 柱后衍生 • 柱前衍生
氨基酸 色谱柱 衍生化后的氨基酸 试剂 检测器
色谱柱
检测器
柱后衍生
氨基酸 色谱柱 试剂 检测器
色谱柱 : 阳离子交换柱
试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器
柱前衍生
氨基酸衍生化 色谱柱
柱前衍生步骤
1. 200uL样品中加入100mM异硫氰酸苯酯
（乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶液） 100uL,室温下放置反应1小时 2. 反应液中加入400uL己烷 3. 放置，取下层溶液用一次性滤膜过滤器 （0 .45um ）过滤 4. 取滤液4uL注入
液相色谱常见问题及故障排除经验
前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10μＬ
血清的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 乳酸 5. 甲酸 6. 乙酸 7. 焦谷氨酸 8. 未知物 前处理 • 加高氯酸用离心法去沉淀物， 取上清液5uL进样
尿样的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 乳酸 4. 甲酸 5. 未知物 6. 焦谷氨酸 7 未知物 前处理 过滤后，进样10μＬ
二甲杀威 （MPMC）
乙硫甲威
XMC
异丙威 （MIPC）
灭定威
苯氧丁威 （BPMC）
甲硫威 （Mercaptodim ethur）
N-甲基氨基甲酸酯 的HPLC分析方法流程图
1、脱气装置
2、低压梯度装置 3、流动相输液机构 4、梯度混合器 5、自动进样器 6、柱温箱 7、分析柱 8、化学反应箱 9、脱气装置 10、反应试剂输液机构 11、混合装置 12、荧光检测器 13、阻尼盘管 14、反应盘管 15、反应盘管 M1，M2：流动相 R1，R2：反应试剂液
如果压力为零： 泵头中没有液体，充满气泡 单向阀完全堵死 泵的柱塞杆折断 压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)
如果有压力但是压力比正常时低： 漏液 单向阀堵塞
压力波动
压力在短时间内剧烈波动。 泵头中有气泡 单向阀脏 柱塞密封圈漏液
经常漏液的部件
泵：柱塞密封圈,排液阀 手动进样器：转子密封圈磨损 检测器： 流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎） 接头处漏液：（接头松动，接头脏，接头磨损， 部件不匹配）
全世界使用的农药超过700种：杀虫剂，除草剂，
农药的残留（1）
有机氯化物：
硫丹、荚蟥醚、克菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、溴 螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄氏 剂、六氯苯、七氯
有机磷化物：
苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，喹硫 磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，敌敌 畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，丰索 磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马拉硫 磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，特 丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷， 甲拌磷
- 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。 家畜及水产品 审查兽药残留
- 牛肉，猪肉等
- 鸡肉、鹌鹑等 - 鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等 - 虾，对虾
食品中的农药残留
杀菌剂，脱叶剂，植物生长调节剂。
残留：残存在农产品中的农药（降解缓慢）及 其代谢物由以下原因所致： - 使用更稳定的化学物质作农药。 - 农药的过度使用以及不合理使用。 最大残留限量(MRL)：食品安全的指标，通常 MRL≤0.01-0.05mg/kg(ppm)
样品的分析实例
食品 • 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等 体液 • 血清，尿等 医药品 • 肾的透析液，钙制剂等 发酵 • 微生物培养液，酸奶等 环境 • 工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 磷酸 柠檬酸 丙酮酸 苹果酸 琥珀酸 乳酸 甲酸 乙酸 乙酰丙酸 焦谷氨酸
残留农药和兽药是食品中主要的污染物
世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是
在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更
加严格的完善。 在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的 检测中非常苛刻的。
食品中残留检测
农产品 - 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 审查农药残留
- 水果：橘柑，苹果，葡萄等。
储液瓶 脱气机 泵单元 混合器
3
4
5
6
自动进样器
色谱柱 检测器 废液瓶
7
8
液相色谱故障排除经验
• 故障的确定 —至少要重复出现两次以上 • 初步判断故障引起的原因 —方法或硬件 • 由经验或平时的积累确定故障原因 —平时做好观察和记录 • 当不能确认故障原因时 —采用排除法逐一考察可能引起故障的因 素 • 确定故障能否自行处理 —不要贸然拆卸不熟悉的部件
-做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命 常做的保养 —保证仪器的使用环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘） —泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不要长期 保存在泵里） —进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路 —尽量进行样品前处理 —色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命 —系统中不要长期保存水和盐，长时间不用时应将仪器所 有部分全部更换为70％以上的甲醇，避免细菌的滋生及 盐的析出。
min.
前处理 过滤后，进样10μＬ
葡萄酒的色谱图
1. 2. 3 . 4. 5. 6. 7. 8. 9.
磷酸 柠檬酸 酒石酸 苹果酸 琥珀酸 乳酸 甲酸 乙酸 焦谷氨酸
前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10μＬ
min.
酱油的色谱图
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
磷酸 柠酸 丙酮酸 苹果酸 琥珀酸 乳酸 甲酸 乙酸 乙酰丙酸 焦谷氨酸
1994年6月9日官报上登载的成分的分析例
16成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标 准试样同时分析的色谱图
甲硫威及其代谢物
甲硫威代谢物高灵敏度分析例
（例如在橘子汁中不得含50ppb以上）
甲硫威的检测限（S/N=3）为2ppb
离子色谱
–离子色谱 –过渡金属分析系统
wk.baidu.com
–CN- 离子分析系统
氨基酸分析系统
酸奶的色谱图
1. 2. 3. 4. 5. 6. 磷酸 柠檬酸 琥珀酸 乳酸 甲酸 乙酸
前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10μＬ
工厂废水的色谱图
1. 甲酸 2. 乙酸 3. 丙酸 4. 碳酸 5. 丁酸 6. 戊酸
前处理 过滤后，进样10μＬ
食品安全与污染物
食品安全是所有国家的每个消费者关心的基本问 题。
农药的残留（2）
氨基甲酸酯：
灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀 威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹
拟除虫菊酯
氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯， 氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯
含氮化合物：
甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，三唑醇，三 唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙环唑，联苯三唑醇，灭锈胺， 灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，敌稗，二甲戊灵，氟乐灵， 多效唑。
保留时间不稳定
吸滤头脏 泵输液不正常（压力波动、气泡等）
流动相组分变化
流动相缓冲能力不够
色谱柱平衡时间不够
柱温的变化 柱子问题
噪音大
流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
漏液
流动相、泵、检测器流通池内有气泡
流动相各溶剂不相溶或混和不均匀
检测池能量不足
流通池被污染
温度影响（检测器和柱温差别太大）
其他电子设备的影响或电源、地线等
基线漂移
流动相污染，变质或由低品质溶剂配成
流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)
温度波动
系统平衡时间不够
流通池被污染或有气泡
流通池窗口破裂
峰形问题
死体积太大 柱子被污染或堵塞 色谱柱塌陷 流动相缓冲不足或不合适 样品溶剂选择不当，与流动相之间极性差异太大 样品过载（浓度或体积） 柱温过低
鬼峰
欧盟和美国现在的形势
在过去几年中，相关法规已完成或修订，控制程 度更加严格。
在欧盟和美国已建立起完整的监测网络（参考实 验室；参考材料及标准；计算机监视小组等） 在样品净化，色谱分离和检测中使用改进的和新 的分析技术及方法，如GC/MS和LC/MS，就会产生 更灵敏，更准确和更可靠的结果。
压力过高时
首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞
色谱柱堵时，确认可能造成堵塞的样品 的性质，相应选择合适的清洗溶剂。
系统堵塞，首先应确认是哪一部份堵塞， 依据情况由后向前进行排除。
容易发生堵塞的部件
保护柱及色谱柱
线路过滤器
混合器过滤组件
管路连接处
进样器 检测器流通池
压力过低
N-甲基氨基甲酸酯的HPLC 分析方法
•N-氨基甲酸甲酯类农药的基本化学结构式
•它们的化合物在碱的条件下加水分解生成甲胺。这里生 成的甲胺与一级胺的荧化衍生化试剂O-苯二甲醛（OPA） 反应，可进行较高灵敏度的荧光检测。
氨基甲酸酯前处理过程
8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试 样同时分析的色谱图
公众比以前更加关注食品安全。
氨基甲酸酯类农药
灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲 丁威，残杀威，恶虫威，克百威 (呋喃丹),速灭 威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹
氨基甲酸酯类农药结构
丁醛肟威
草肟威
乙肟威
呋喃丹
CPMC
甲氧威 （MTMC）
残杀威 （PHC， Arprocarb）
苯噁威
甲萘威 （NAC）
常见故障因素
• 仪器环境： —实验室的温度、湿度、酸度等 —实验室震动、灰尘等问题 —电源及地线问题 • 使用条件： —流动相（pH值、均匀度、气泡等） —样品（样品分解、氧化、样品溶剂等） —色谱柱（污染、堵塞、塌陷等） • 硬件问题： —输液泵 —进样器 —检测器
平常保养
-做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率
流动相被污染
进样阀残余峰
样品中未知物 色谱柱中的污染物
管线选择
材料
不锈钢 Teflon (聚四氟乙烯) PEEK (聚醚醚酮)
尺寸
0.1 mm I.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mm I.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mm I.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mm I.D. x 1.6 mmO.D.
Column : Reagent :
异硫氰酸苯脂（PITC）
检察器
Revered Phase Column (ODS) OPA (Fluorescence) FMOC (Fluorescence) Fluorescamine (Fluorescence) DANS-Cl (Fluorescence) PITC (UV)
液相系统维护流程图
线路过滤器
单向阀
色谱柱
检测器
柱塞密封圈 手动进样器
吸滤头
等度系统
1 2 3 储液瓶
脱气机
泵单元
手动进样器 4
色谱柱 5 检测器 6
废液瓶
低压梯度系统
1 2 3 4 5 6 7 8 储液瓶 脱气机 低压梯度单元
泵单元
混合器 自动进样器 色谱柱 检测器 废液瓶
9
高压梯度系统
1 2
啤酒的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 焦谷氨酸 10. 碳酸 前处理 振荡除去碳酸气后， 过滤10μＬ进样
清酒的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 乙酸 8. 焦谷氨酸