变形链球菌gcp基因突变菌株的构建及鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
剂盒提 取 质粒 ，获得 ｐ Ａ８ － ｃ 。 Ｖ ９ ２ ｇ ｐ １ １ ７变 形链 球菌 感 受态 细胞 的制 备及 转化 ． 挑
取 试剂 盒 、Ｄ ｒｅ（Ｌ ＮＡ Ｍａｋ ｒ￣ 京天 为 时代 公 司 ） Ｂ ；Ｌ
培 养基 、Ｂ 培 养基 （ ｘ ｉ ，Ｅ ｇａ ｄ Ｍ２ ５ ， ＨＩ Ｏ ｏｄ ｎ ｌｎ ，Ｃ ２ ） 氨苄 青霉素（ Ａｍｐ 浓 度 １ ０ ／ ） ０ ｍｇ ｍＬ，红 霉 素 分 别
杨德 鸿
吴补 领
南方医科 大学南方 医院脊柱 骨科
５１ ０５１ ５
副教授
广 东
连宝 生物工程有 限公司） Ｖ ８ｌ ；Ｐ Ａ ９ ２自杀载 体
（ ｏ ｅ ｅｏ ｗｃ ｓｌ， ｎ ｌｎ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｌ Ｎｅ ａｔ Ｅ ｇａ ｄ ，全 长 约 ２ ９ｋ ｅ ． ｂ， 含 有多 克隆位 点 。
ｙ Ⅳ Ｗｅ － ｕｎ Ｙ Ｎ ｅ ｈ ｎ ， ｕ ｌ ｇ （ ｐ ｒ ｎ ｏ ｔ ｔｌｇ ，Ｎ ｎ ｎ ｓｉ ｌ ｏ ｔｅｎＭｅｉ ｌ Ａ ｎ ｊａ ， Ａ Ｇ Ｄ — ｏ ｇ ｗｕ Ｂ — ｉ ． Ｄｅａｔ ｔ ｆＳｏ ｏｏｙ ｎ ｍｅ ｍａ ａｆ ｇＨｏｐｔ ， ｕ ｒ ｄｃ ａ ａＳ ｈ ａ
・
论著 ・
术 变形链 球菌 ｇｐ基 因突 变菌株 的构建 及鉴定 ｃ
闫文 娟
杨德 鸿
吴 补 领
【 摘要 】 目的 ：构 建变 形链球 菌 ｇ ｐ基 因突变菌株 ，以便研究变形 链球 菌 ｇ ｐ基 因功 能。方法 ：厌氧培养变 ｃ ｃ
形 链 球 菌 ＵＡ１９ 以前 期 研 究 中 ｐ ５， ＭＤ１Ｔ ｇ ｐ为 模 板 ，Ｐ Ｒ 扩 增 ｇ ｐ基 因 内 部 序 列 ，连 接 自杀 载 体 ｐ ９－ｃ Ｃ ｃ ＶＡ８ １ ， ９ ２ 酶 切 鉴 定 ；将 鉴 定 正 确 的 质 粒 转 化 变 形 链 球 菌 ＵＡ１ ９ ５ ，挑 取 阳 性 克 隆 ，提 取 基 因组 Ｄ ＮＡ，用 Ｐ Ｒ 结 合 酶 切 鉴 Ｃ 定 。结 果 ：发现 ＰＣ 产 物 及 插 入 片 段 大 小 与 预 期 值 相 符 ，表 明 成 功 构 建 了 重 组 质粒 ｐ Ａ８ １／ ｃ Ｒ Ｖ ９ ２ ｇ ｐ；经 Ｐ Ｒ 鉴 Ｃ
按 照细 菌 基 因组 Ｄ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 的 说 明 提 取
轻 晃 动 后 ３ ℃孵 育 ３ ｍｉ ，加 入 ｌ ７ ７ ０ ｎ ｍｌ ℃预 热 的 ３
为 ４０ ５０ｍｇ ＬＥ．ｏ ） ２ ／ （ ｍｕａ ｓ。 ０ － ０ ／ （ ｃｉ和 ０ｍｇ ＬＳ． ｔｎ） ｌ
１ ３ 变 形 链 球 菌 ＵＡｌ９的 Ｄ ． ５ ＮＡ 提 取 用 磷
酸 盐 缓 冲液 （Ｂ ） Ｐ Ｓ复苏 变 形链 球 菌 ＵＡ１９冻干 粉 ， ５
ｓｒｅ ｓｔ ｌ ｅ ａｄＰ Ｒ ｗ ｓｐｒ ｒ ｄｔ ｍｐｉ ｃ ｅｕ ｎｅ（７ ｂ ） ｆｌ ｗｅ ｙｃ ｎ ｅｔ ｎｗｉ ｅｖｄ ａ ｅ ａ ， ｎ Ｃ ａ ｅｆ ｍｅ ｏａ ｌｙ ｇｐ ｓｑ ｅｃ ８ ３ｐ ， ｏｌ ｄｂ ｏ ｎｃｉ ｔ ｔ Ｔ ｍｐ ｔ ｏ ｆ ｏ ｏ ｈｏ
３： １的 比 例 ，用 Ｔ ４ＤＮＡ 连 接 酶 于 １ ℃连 接 过 ６
公 司） ；凝 胶 回收 试 剂 盒 （ ｌｎｅｈ公 司 ） Ｃｏ ｔｃ ；质 粒 小
量提 取 试剂 盒 （ ｍｅ ａ公 司） Ｏ ｇ ；细 菌基 因组 Ｄ ＮＡ 提
夜 ，转 化 Ｅ ｃｌＴ ｐ Ｏ感 受态 细胞 后 ，在 含 红 霉素 ． ｉ ｏｌ ｏ 的Ｌ Ｂ培 养板 上筛选 阳性克 隆 ，用质 粒小 量 提取 试
于 Ｂ 培 养 基 划 线 复苏 培 养 ，经 革 兰 氏 染色和 生 ＨＩ 化 鉴定后 ，在厌氧箱内（ ８ ％、 Ｃ ２： ％、Ｈ２： Ｎ２： ５ Ｏ ５
１ Ｏ％） ７ ３ ℃厌氧 培 养 ４ ｈ，挑取 单 克 隆 接种 于 新 鲜 ８ 配 制 的 Ｂ 培 养 液 中 ，培 养 ２ ｈ，取 ３ 菌 液 ， ＨＩ ４ ｍｌ
１２ 主 要 试 剂 Ｌ ｑ Ｄ ． Ａ Ｔａ ＮＡ 聚 合 酶 、 Ｔ
通 讯 作 者 南方 医科 大 学 １腔 医 学 院 ３ ＇
教授 广Βιβλιοθήκη Baidu ５ ０ １ １ ５５
主 任 医 师
・
３ ５・ ２
中 老年 腔 学 华 口 医 杂志２ １ 年 １ 月第 ９ ０１ １ 卷第６ 期
１ 材料与方法 ．
１１ 菌 株 和 质 粒 ． ．ｍｕａｓＵＡ１９ 四 川 大 学 ｓ ｔ ． ｎ ５（
闰 文 娟 南 方 医科 大 学 南 方 医院 口腔 科
５１ ０５１ ５
主 治 医师 广 东
华 西 口腔医 院） Ｅｃｌ ； ． ｉ ｏ
１ 、ｐ ０ ＭＤ－１Ｔ 质粒 （ ９ 大
面 ，是 细菌 生存 和 代谢 的关 键 性调 节 因子 之一 ｎ 一。 在 前 期 的 研 究 中我 们 证 实 变 形 链 球 菌 内 部 存 在
基 金项 目：国 家 自然科 学基 金 青 年 基 金 资助 项 目ｆ 目编 项
号 ：８ １ ０ ４ １ １ ０ ７ ７
（ Ｏ１ １ ３基 因突 变 株 ，为 下 一 步 的 变 形 链球 菌 ＡＥ ４ ３ ） ｃ ｄ— ＭＰ功 能及 多种 防龋 机制 的研 究奠定 基础 。 — ｉＧ
ｖ ｃ ｏ ， Ｔ ｅ ｇ ｎ ａ ｓ ｉ ｓ ｒ ｄ ｉ ｔ ｕ ｃ ｄ ｅ ｔ ｒｐ ｅ ｔｒ ｈ ｅ ｅ ｆ ｍｅ ｗａ ｎ ｅ ｔ ｎ ｏ ｓ ｉｉ ｅ ｖ ｃｏ ＶＡ８ １ ｌ ｅ ９ ２， Ｔ ｅ ＶＡ８ １ ／ ｃ ｓｔａ ｓｏ ｍｅ ｎ ｏ ＵＡ１ ９ ｈｎｐ ９ ２ ｇ ｐ ｗａ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｔ ５
ｃ ｄ－ － ｉ ＧＭＰ信 号 通 路 ，可 影 响变 形 链 球 菌 的 生 物 膜形 成 和 在 牙齿 表 面 的黏 附 等 ，但 其 作 用机 制 未
是 公 认 的主 要 致 龋 菌 ，变 形 链 球 菌 在 牙 齿 表 面黏
附 、聚集 并形 成 菌斑 生物 膜 是其 致 龋 的关 键 因素 。 环 鸟 苷 二 磷 酸 （ ’５ －Ｃ ｃｉ ｄｇ ａ ｙｉ ｃ ３ ， ’ ｙ ｌ ｉｕ ｎ ｌ ａｉ ｃ ｃ ｄ；
Ｃ ＩＥ Ｅ Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｅ Ｉ ＲＣＤ Ｎ ＩＴ Ｙ Ｎ Ｖ Ｍ Ｅ ０ １Ｖ Ｌ Ｏ６ ＨＮ Ｓ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ Ｇ ＲＡ Ｉ Ｅ Ｔ Ｒ Ｏ Ｅ Ｂ Ｒ ２ １ Ｏ ． Ｎ ． Ｔ Ｓ ９
ＤＮＡ 连接 酶和 限制 性 内切酶 （ 大连 宝 生物 工程 有限
Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｃ ｌ ｇ Ｓｏ ａｏｏ ｙ ｕ ｎ ｄ ｎ １ ５５ Ｃ ｉａ ｎｖ ｓｙ ｏｌ ｅｏ ｔｍ ｔｌ ，Ｑ ａｇ ｏｇ５ ０ １ ， ｈｎ ） ｅ ｔ ｅ ｆ ｇ
【 ｓｒ ｃ］ ０ｂ ｅ ｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｔ ｐｏ ｏ ｃ ｓ Ｍｕａ ｓ ｉ ｃ ｅ ｅｋ ｏ ｋ ｕ ｔ ｔＭｅｈ ｄ ：ｐ Ｔ ｇ ｐ ｗ ｓ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃ ｖ ： ｏ ｃ ｎ ｔ ｃ ｒ ｔｃ ｃ ｕ ｔ ｔ ｇ ｐｇ ｎ ｎ ｃ ｏ ｔ ａ ． ｔ ｏ ｓ ＭＤ１ —ｃ ａ ｉ ｒ ｓｅ ｎ ｗ ｈ ｍｕ ｎ ９
ｈ ｔ ｔ ｅｓ ｙ ｆｔ ｅｆ ｃ ｉｎ ｕｄ ｏ ｈ ｕｎ ｔｏ ｏｆｇ ｐ ｇ ｎ ｃ ｅ ｅ． Ｋｅｙｗ ｏ ｄｓ ｔｅ ｔ ｃ ｃ ｓｍｕｔｎｓ ｇｅ ｎａ ｔｖ ｔｏ ｇｃ ＰＣＲ ｒ ：ｓｒ ｐ ｏ ｏｃ ｕ ａ ； ｎｅｉ ｃｉ ａ ｉｎ； ｐ；
牙 菌 斑 生物 膜 是 龋病 的 始动 因子 ， 形 链 球菌 变
定 ：ｇ ｐ基 因失活株基 因组 中 ｇ ｐ基 因内部成 功插入了重组载体片段 。结 论 ：成 功构建 了变形链球 菌 ｇ ｐ基因失 ｃ ｃ ｃ
活 株 ，为 该 基 因功 能 的研 究奠 定 了基 础 。
关 键 词 ： 形 链 球 菌 ；基 因失 活 ；ｇ ｐ 变 ｃ ；聚 合 酶 链 反 应
［ 中国图书分类号】 ７ １ Ｒ ８
［ 文献标识码】 Ａ
［ 文章编号】６ ２ ２ ７ （０ ）６ ０ ２ － ４ ｌ７ — ９ ３２ １ ０ － ３ ５ ０ １
Ｃｏｎｓｒ ｔｏ ａ ｄｅ ｉ ｃ ｔｏｎ ｏ ｔ ｅ ｏ ｏｃ ｕｓ Ｍ ｕｔ ｎｓｗｉｈ ｃ ｎｅＫ ｎｏ ｏｕｔ ｕｔ ｔ ｔ ｕｃｉ ｎ ｎｄ ｉ ｎｔｆ ａ ｉ ｆＳ ｒ ｐｔ ｃ ｃ ｉ ａ ｔ ｇ ｐ ｇｅ ｃｋ ｍ ａｎ
明 ，基 因重组技 术 为变形 链球 菌致 龋毒 力基 因功 能
的研 究提 供 了一个 有 力 的工 具 ｆ ３ ］ 研 究拟 构 建变 。本 形 链 球 菌 中 ｃ ｄ— ＭＰ 相 关 蛋 白 基 因 ｇ ｌ — ｉＧ ｅ ３
ｃ ｄ— ＭＰ 是 近 年 来 发 现 的 细 菌 第 二 信 使 ， 它 的 — ｉＧ ） 作 用 涉 及 生 物 膜 形 成 、 毒 力 因 子 的 表 达 等 多个 方
取变 形链 球菌 ＵＡ１９单 克 隆接种 于 Ｂ 液 体培 养 ５ ＨＩ 基培 养 ｌ ８ｈ，取 １０ ０ Ｌ变形 链球 菌 液接 种 入 ５ ｍＬ 的 Ｂ Ｓ含 ５ ＨＩ（ ％马血清） ７Ｃ ，３ ￣厌氧培养 １ ｈ。从 上述 ８ 菌液 中取 出 １ ０ ｌ 入到 ３ ￣ 热的 Ｂ Ｓ中 ，培 ０ｕ 加 ７ Ｃ预 ＨＩ 养３ ｈ，加入 １ ￣ ／ ０ ｇ ｍＬ的 ｐ Ａ８ １ － ｃ Ｖ ９ ２ ｇ ｐ质粒 ，轻
ｇ ｎ ｍｉ ｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｆｔ ｅ ｐ ｓｔ ｅ ｃｏ ｅ Ｒｅ ｕ ｔ ：Ｅ ｚ ｍａｉ ｎ ｌ ｓ ｏ ｎ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔｏ ＣＲ ａ ｅ ｓ ｍｅ ｓｚ ｓｔ ｅ ｏ ｏ ｉｖ ｌ ｎ ． ｈ ｉ ｓｌ ｓ ｎ ｙ ｔ ａ ａｙ ｉ ｆ ｕ ｄ ｔ ｒ ｄ ｃ ｆＰ ｃ ｓ ｈ ｈ ｄ ｔ ａ ｉｅ ａ ｈ ｈ ｉ ｓ ｒ ｄ ｐ ｅ ｅ ｗｈ ｃ ｍｐ ｉｓ ｔ ｅ ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｎ ｏ ＶＡ８ ／ ｃ ｓ ｓ ｃ ｅ ｓ １ ｈ ｃ ｔ ｎ ｓ ｉ ｅ ｔ ｅ ｙ Ｐ ｎ ｅ ｅ ｉｃ ， ｔ ｉｈ ｉ ｌ ｏ ｓ ｃ ｉ ｆ ｅ ｈ ｒ ｏ ｐ ９ ｇ ｐ ｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ． ｅ ｇ ｐ ｍｕａ ｔｗａ ｄ ｎ ｉ ｄ ｂ ＣＲ． １ ２ ｕ Ｔ ｉ ｆ Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｔｈ ｏ ｓｒ ｃｉ ｎ ｏ ． ｕ ａ ｓ ｔ ｃ ｅ ｅ ｋ ｏ ｋ ｕ ｔｎ ｓｓ ｃ ｅ ｓｕ ｉｈ ｐ ｏ ｉ ｅ ｅｅ ｅ ｃ ｏ ｎ ｌ ｓ ： ｅ ｃ ｎ ｔ ｔ ｆＳ Ｍ ｔ ｎ ｈ ｇ ｐ ｇ ｎ ｎ ｃ ｏ ｔ ｏ ｕ ｏ ｗｉ ｍｕ ａ ｔ ｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｗｈ ｃ ｒ ｖ ｄ ｓａｒ ｆ ｒ ｎ ｅｆ ｒ
ａ ｄ ｐｏ ｉｉ ｌ ｎｅ ｗａ ｓ ｌｃｅ ｎ ｓｔｖｅ ｃ ｏ ｓ ｅｅ ｔｄ．Ｔｈ ｅｅｃｅ ｌｎｅ ｗ ａ ｈｅ ｒｆｅ ｙ ｅ ｓ ｌ ｔ ｄ ｃｏ ｓｔ ｎ ｖｅ ｉ ｄ ｂ ＰＣＲ ｎｄ ｅ ｙ ａ ｉ ｎａｙｓｓ ｏ ｔ ｅ ｅ ｔａ ｔ ｄ ｉ ａ ｎｚ ｍ ｔｃ ａ ｌ ｉ ｎ ｈ ｘｒ ｃ ｅ
Ｃ ＩＥ Ｅ Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｅ Ｉ Ｒ Ｄ Ｎ ＩＴ Ｙ Ｎ Ｖ Ｍ Ｅ ０ １Ｖ Ｌ Ｏ ６ ＨＮ Ｓ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ Ｇ ＲＡ Ｉ Ｅ ＴＳ Ｒ Ｏ Ｅ Ｂ Ｒ ２ １ Ｏ ． Ｎ ． Ｔ Ｃ ９
中 年船 学 华老 腔医 杂志２ １ 年 １ 月第 ９ ０１ １ 卷第 ６ 期
取 试剂 盒 、Ｄ ｒｅ（Ｌ ＮＡ Ｍａｋ ｒ￣ 京天 为 时代 公 司 ） Ｂ ；Ｌ
培 养基 、Ｂ 培 养基 （ ｘ ｉ ，Ｅ ｇａ ｄ Ｍ２ ５ ， ＨＩ Ｏ ｏｄ ｎ ｌｎ ，Ｃ ２ ） 氨苄 青霉素（ Ａｍｐ 浓 度 １ ０ ／ ） ０ ｍｇ ｍＬ，红 霉 素 分 别
杨德 鸿
吴补 领
南方医科 大学南方 医院脊柱 骨科
５１ ０５１ ５
副教授
广 东
连宝 生物工程有 限公司） Ｖ ８ｌ ；Ｐ Ａ ９ ２自杀载 体
（ ｏ ｅ ｅｏ ｗｃ ｓｌ， ｎ ｌｎ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｌ Ｎｅ ａｔ Ｅ ｇａ ｄ ，全 长 约 ２ ９ｋ ｅ ． ｂ， 含 有多 克隆位 点 。
ｙ Ⅳ Ｗｅ － ｕｎ Ｙ Ｎ ｅ ｈ ｎ ， ｕ ｌ ｇ （ ｐ ｒ ｎ ｏ ｔ ｔｌｇ ，Ｎ ｎ ｎ ｓｉ ｌ ｏ ｔｅｎＭｅｉ ｌ Ａ ｎ ｊａ ， Ａ Ｇ Ｄ — ｏ ｇ ｗｕ Ｂ — ｉ ． Ｄｅａｔ ｔ ｆＳｏ ｏｏｙ ｎ ｍｅ ｍａ ａｆ ｇＨｏｐｔ ， ｕ ｒ ｄｃ ａ ａＳ ｈ ａ
・
论著 ・
术 变形链 球菌 ｇｐ基 因突 变菌株 的构建 及鉴定 ｃ
闫文 娟
杨德 鸿
吴 补 领
【 摘要 】 目的 ：构 建变 形链球 菌 ｇ ｐ基 因突变菌株 ，以便研究变形 链球 菌 ｇ ｐ基 因功 能。方法 ：厌氧培养变 ｃ ｃ
形 链 球 菌 ＵＡ１９ 以前 期 研 究 中 ｐ ５， ＭＤ１Ｔ ｇ ｐ为 模 板 ，Ｐ Ｒ 扩 增 ｇ ｐ基 因 内 部 序 列 ，连 接 自杀 载 体 ｐ ９－ｃ Ｃ ｃ ＶＡ８ １ ， ９ ２ 酶 切 鉴 定 ；将 鉴 定 正 确 的 质 粒 转 化 变 形 链 球 菌 ＵＡ１ ９ ５ ，挑 取 阳 性 克 隆 ，提 取 基 因组 Ｄ ＮＡ，用 Ｐ Ｒ 结 合 酶 切 鉴 Ｃ 定 。结 果 ：发现 ＰＣ 产 物 及 插 入 片 段 大 小 与 预 期 值 相 符 ，表 明 成 功 构 建 了 重 组 质粒 ｐ Ａ８ １／ ｃ Ｒ Ｖ ９ ２ ｇ ｐ；经 Ｐ Ｒ 鉴 Ｃ
按 照细 菌 基 因组 Ｄ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 的 说 明 提 取
轻 晃 动 后 ３ ℃孵 育 ３ ｍｉ ，加 入 ｌ ７ ７ ０ ｎ ｍｌ ℃预 热 的 ３
为 ４０ ５０ｍｇ ＬＥ．ｏ ） ２ ／ （ ｍｕａ ｓ。 ０ － ０ ／ （ ｃｉ和 ０ｍｇ ＬＳ． ｔｎ） ｌ
１ ３ 变 形 链 球 菌 ＵＡｌ９的 Ｄ ． ５ ＮＡ 提 取 用 磷
酸 盐 缓 冲液 （Ｂ ） Ｐ Ｓ复苏 变 形链 球 菌 ＵＡ１９冻干 粉 ， ５
ｓｒｅ ｓｔ ｌ ｅ ａｄＰ Ｒ ｗ ｓｐｒ ｒ ｄｔ ｍｐｉ ｃ ｅｕ ｎｅ（７ ｂ ） ｆｌ ｗｅ ｙｃ ｎ ｅｔ ｎｗｉ ｅｖｄ ａ ｅ ａ ， ｎ Ｃ ａ ｅｆ ｍｅ ｏａ ｌｙ ｇｐ ｓｑ ｅｃ ８ ３ｐ ， ｏｌ ｄｂ ｏ ｎｃｉ ｔ ｔ Ｔ ｍｐ ｔ ｏ ｆ ｏ ｏ ｈｏ
３： １的 比 例 ，用 Ｔ ４ＤＮＡ 连 接 酶 于 １ ℃连 接 过 ６
公 司） ；凝 胶 回收 试 剂 盒 （ ｌｎｅｈ公 司 ） Ｃｏ ｔｃ ；质 粒 小
量提 取 试剂 盒 （ ｍｅ ａ公 司） Ｏ ｇ ；细 菌基 因组 Ｄ ＮＡ 提
夜 ，转 化 Ｅ ｃｌＴ ｐ Ｏ感 受态 细胞 后 ，在 含 红 霉素 ． ｉ ｏｌ ｏ 的Ｌ Ｂ培 养板 上筛选 阳性克 隆 ，用质 粒小 量 提取 试
于 Ｂ 培 养 基 划 线 复苏 培 养 ，经 革 兰 氏 染色和 生 ＨＩ 化 鉴定后 ，在厌氧箱内（ ８ ％、 Ｃ ２： ％、Ｈ２： Ｎ２： ５ Ｏ ５
１ Ｏ％） ７ ３ ℃厌氧 培 养 ４ ｈ，挑取 单 克 隆 接种 于 新 鲜 ８ 配 制 的 Ｂ 培 养 液 中 ，培 养 ２ ｈ，取 ３ 菌 液 ， ＨＩ ４ ｍｌ
１２ 主 要 试 剂 Ｌ ｑ Ｄ ． Ａ Ｔａ ＮＡ 聚 合 酶 、 Ｔ
通 讯 作 者 南方 医科 大 学 １腔 医 学 院 ３ ＇
教授 广Βιβλιοθήκη Baidu ５ ０ １ １ ５５
主 任 医 师
・
３ ５・ ２
中 老年 腔 学 华 口 医 杂志２ １ 年 １ 月第 ９ ０１ １ 卷第６ 期
１ 材料与方法 ．
１１ 菌 株 和 质 粒 ． ．ｍｕａｓＵＡ１９ 四 川 大 学 ｓ ｔ ． ｎ ５（
闰 文 娟 南 方 医科 大 学 南 方 医院 口腔 科
５１ ０５１ ５
主 治 医师 广 东
华 西 口腔医 院） Ｅｃｌ ； ． ｉ ｏ
１ 、ｐ ０ ＭＤ－１Ｔ 质粒 （ ９ 大
面 ，是 细菌 生存 和 代谢 的关 键 性调 节 因子 之一 ｎ 一。 在 前 期 的 研 究 中我 们 证 实 变 形 链 球 菌 内 部 存 在
基 金项 目：国 家 自然科 学基 金 青 年 基 金 资助 项 目ｆ 目编 项
号 ：８ １ ０ ４ １ １ ０ ７ ７
（ Ｏ１ １ ３基 因突 变 株 ，为 下 一 步 的 变 形 链球 菌 ＡＥ ４ ３ ） ｃ ｄ— ＭＰ功 能及 多种 防龋 机制 的研 究奠定 基础 。 — ｉＧ
ｖ ｃ ｏ ， Ｔ ｅ ｇ ｎ ａ ｓ ｉ ｓ ｒ ｄ ｉ ｔ ｕ ｃ ｄ ｅ ｔ ｒｐ ｅ ｔｒ ｈ ｅ ｅ ｆ ｍｅ ｗａ ｎ ｅ ｔ ｎ ｏ ｓ ｉｉ ｅ ｖ ｃｏ ＶＡ８ １ ｌ ｅ ９ ２， Ｔ ｅ ＶＡ８ １ ／ ｃ ｓｔａ ｓｏ ｍｅ ｎ ｏ ＵＡ１ ９ ｈｎｐ ９ ２ ｇ ｐ ｗａ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｔ ５
ｃ ｄ－ － ｉ ＧＭＰ信 号 通 路 ，可 影 响变 形 链 球 菌 的 生 物 膜形 成 和 在 牙齿 表 面 的黏 附 等 ，但 其 作 用机 制 未
是 公 认 的主 要 致 龋 菌 ，变 形 链 球 菌 在 牙 齿 表 面黏
附 、聚集 并形 成 菌斑 生物 膜 是其 致 龋 的关 键 因素 。 环 鸟 苷 二 磷 酸 （ ’５ －Ｃ ｃｉ ｄｇ ａ ｙｉ ｃ ３ ， ’ ｙ ｌ ｉｕ ｎ ｌ ａｉ ｃ ｃ ｄ；
Ｃ ＩＥ Ｅ Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｅ Ｉ ＲＣＤ Ｎ ＩＴ Ｙ Ｎ Ｖ Ｍ Ｅ ０ １Ｖ Ｌ Ｏ６ ＨＮ Ｓ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ Ｇ ＲＡ Ｉ Ｅ Ｔ Ｒ Ｏ Ｅ Ｂ Ｒ ２ １ Ｏ ． Ｎ ． Ｔ Ｓ ９
ＤＮＡ 连接 酶和 限制 性 内切酶 （ 大连 宝 生物 工程 有限
Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｃ ｌ ｇ Ｓｏ ａｏｏ ｙ ｕ ｎ ｄ ｎ １ ５５ Ｃ ｉａ ｎｖ ｓｙ ｏｌ ｅｏ ｔｍ ｔｌ ，Ｑ ａｇ ｏｇ５ ０ １ ， ｈｎ ） ｅ ｔ ｅ ｆ ｇ
【 ｓｒ ｃ］ ０ｂ ｅ ｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｔ ｐｏ ｏ ｃ ｓ Ｍｕａ ｓ ｉ ｃ ｅ ｅｋ ｏ ｋ ｕ ｔ ｔＭｅｈ ｄ ：ｐ Ｔ ｇ ｐ ｗ ｓ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃ ｖ ： ｏ ｃ ｎ ｔ ｃ ｒ ｔｃ ｃ ｕ ｔ ｔ ｇ ｐｇ ｎ ｎ ｃ ｏ ｔ ａ ． ｔ ｏ ｓ ＭＤ１ —ｃ ａ ｉ ｒ ｓｅ ｎ ｗ ｈ ｍｕ ｎ ９
ｈ ｔ ｔ ｅｓ ｙ ｆｔ ｅｆ ｃ ｉｎ ｕｄ ｏ ｈ ｕｎ ｔｏ ｏｆｇ ｐ ｇ ｎ ｃ ｅ ｅ． Ｋｅｙｗ ｏ ｄｓ ｔｅ ｔ ｃ ｃ ｓｍｕｔｎｓ ｇｅ ｎａ ｔｖ ｔｏ ｇｃ ＰＣＲ ｒ ：ｓｒ ｐ ｏ ｏｃ ｕ ａ ； ｎｅｉ ｃｉ ａ ｉｎ； ｐ；
牙 菌 斑 生物 膜 是 龋病 的 始动 因子 ， 形 链 球菌 变
定 ：ｇ ｐ基 因失活株基 因组 中 ｇ ｐ基 因内部成 功插入了重组载体片段 。结 论 ：成 功构建 了变形链球 菌 ｇ ｐ基因失 ｃ ｃ ｃ
活 株 ，为 该 基 因功 能 的研 究奠 定 了基 础 。
关 键 词 ： 形 链 球 菌 ；基 因失 活 ；ｇ ｐ 变 ｃ ；聚 合 酶 链 反 应
［ 中国图书分类号】 ７ １ Ｒ ８
［ 文献标识码】 Ａ
［ 文章编号】６ ２ ２ ７ （０ ）６ ０ ２ － ４ ｌ７ — ９ ３２ １ ０ － ３ ５ ０ １
Ｃｏｎｓｒ ｔｏ ａ ｄｅ ｉ ｃ ｔｏｎ ｏ ｔ ｅ ｏ ｏｃ ｕｓ Ｍ ｕｔ ｎｓｗｉｈ ｃ ｎｅＫ ｎｏ ｏｕｔ ｕｔ ｔ ｔ ｕｃｉ ｎ ｎｄ ｉ ｎｔｆ ａ ｉ ｆＳ ｒ ｐｔ ｃ ｃ ｉ ａ ｔ ｇ ｐ ｇｅ ｃｋ ｍ ａｎ
明 ，基 因重组技 术 为变形 链球 菌致 龋毒 力基 因功 能
的研 究提 供 了一个 有 力 的工 具 ｆ ３ ］ 研 究拟 构 建变 。本 形 链 球 菌 中 ｃ ｄ— ＭＰ 相 关 蛋 白 基 因 ｇ ｌ — ｉＧ ｅ ３
ｃ ｄ— ＭＰ 是 近 年 来 发 现 的 细 菌 第 二 信 使 ， 它 的 — ｉＧ ） 作 用 涉 及 生 物 膜 形 成 、 毒 力 因 子 的 表 达 等 多个 方
取变 形链 球菌 ＵＡ１９单 克 隆接种 于 Ｂ 液 体培 养 ５ ＨＩ 基培 养 ｌ ８ｈ，取 １０ ０ Ｌ变形 链球 菌 液接 种 入 ５ ｍＬ 的 Ｂ Ｓ含 ５ ＨＩ（ ％马血清） ７Ｃ ，３ ￣厌氧培养 １ ｈ。从 上述 ８ 菌液 中取 出 １ ０ ｌ 入到 ３ ￣ 热的 Ｂ Ｓ中 ，培 ０ｕ 加 ７ Ｃ预 ＨＩ 养３ ｈ，加入 １ ￣ ／ ０ ｇ ｍＬ的 ｐ Ａ８ １ － ｃ Ｖ ９ ２ ｇ ｐ质粒 ，轻
ｇ ｎ ｍｉ ｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｆｔ ｅ ｐ ｓｔ ｅ ｃｏ ｅ Ｒｅ ｕ ｔ ：Ｅ ｚ ｍａｉ ｎ ｌ ｓ ｏ ｎ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔｏ ＣＲ ａ ｅ ｓ ｍｅ ｓｚ ｓｔ ｅ ｏ ｏ ｉｖ ｌ ｎ ． ｈ ｉ ｓｌ ｓ ｎ ｙ ｔ ａ ａｙ ｉ ｆ ｕ ｄ ｔ ｒ ｄ ｃ ｆＰ ｃ ｓ ｈ ｈ ｄ ｔ ａ ｉｅ ａ ｈ ｈ ｉ ｓ ｒ ｄ ｐ ｅ ｅ ｗｈ ｃ ｍｐ ｉｓ ｔ ｅ ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｎ ｏ ＶＡ８ ／ ｃ ｓ ｓ ｃ ｅ ｓ １ ｈ ｃ ｔ ｎ ｓ ｉ ｅ ｔ ｅ ｙ Ｐ ｎ ｅ ｅ ｉｃ ， ｔ ｉｈ ｉ ｌ ｏ ｓ ｃ ｉ ｆ ｅ ｈ ｒ ｏ ｐ ９ ｇ ｐ ｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ． ｅ ｇ ｐ ｍｕａ ｔｗａ ｄ ｎ ｉ ｄ ｂ ＣＲ． １ ２ ｕ Ｔ ｉ ｆ Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｔｈ ｏ ｓｒ ｃｉ ｎ ｏ ． ｕ ａ ｓ ｔ ｃ ｅ ｅ ｋ ｏ ｋ ｕ ｔｎ ｓｓ ｃ ｅ ｓｕ ｉｈ ｐ ｏ ｉ ｅ ｅｅ ｅ ｃ ｏ ｎ ｌ ｓ ： ｅ ｃ ｎ ｔ ｔ ｆＳ Ｍ ｔ ｎ ｈ ｇ ｐ ｇ ｎ ｎ ｃ ｏ ｔ ｏ ｕ ｏ ｗｉ ｍｕ ａ ｔ ｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｗｈ ｃ ｒ ｖ ｄ ｓａｒ ｆ ｒ ｎ ｅｆ ｒ
ａ ｄ ｐｏ ｉｉ ｌ ｎｅ ｗａ ｓ ｌｃｅ ｎ ｓｔｖｅ ｃ ｏ ｓ ｅｅ ｔｄ．Ｔｈ ｅｅｃｅ ｌｎｅ ｗ ａ ｈｅ ｒｆｅ ｙ ｅ ｓ ｌ ｔ ｄ ｃｏ ｓｔ ｎ ｖｅ ｉ ｄ ｂ ＰＣＲ ｎｄ ｅ ｙ ａ ｉ ｎａｙｓｓ ｏ ｔ ｅ ｅ ｔａ ｔ ｄ ｉ ａ ｎｚ ｍ ｔｃ ａ ｌ ｉ ｎ ｈ ｘｒ ｃ ｅ
Ｃ ＩＥ Ｅ Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｅ Ｉ Ｒ Ｄ Ｎ ＩＴ Ｙ Ｎ Ｖ Ｍ Ｅ ０ １Ｖ Ｌ Ｏ ６ ＨＮ Ｓ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ Ｇ ＲＡ Ｉ Ｅ ＴＳ Ｒ Ｏ Ｅ Ｂ Ｒ ２ １ Ｏ ． Ｎ ． Ｔ Ｃ ９
中 年船 学 华老 腔医 杂志２ １ 年 １ 月第 ９ ０１ １ 卷第 ６ 期