流式细胞术样品制备(完整)

一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
⑥消化30分钟后，立即加入生理盐水终止消化。 ⑦经300目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以 二次消化。 ⑧收集细胞悬液，离心沉淀1500prm，以生理盐 水漂洗1-2次，离心沉淀1500prm，再以生理盐 水漂洗1-2次，离心沉淀500-800prm，去碎片。 ⑨制备好的单细胞悬液作涂片，AO染色在荧光 显微镜下观察，应为完整细胞核，核发出黄绿 色荧光。 ⑩单细胞样品1×106细胞/ml，加入荧光染液溴化 乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4℃冰箱30 分钟，经300目尼龙网过滤后上机检测。
三、脱落细胞单细胞悬液的制备
在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落 的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可 得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞 术检测的天然样品，下面介绍几种常见的脱落 细胞样品制备方法。
酶学方法的一般程序： ①将适合于酶消化的组织置于离心管中。 ②将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试 管中。 ③一般消化20-30分钟(恒温37º C或室温)，消化期 间要间接振荡或吹打。 ④终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过 滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。 ⑤将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。
网搓法： ①将100目铜网扎在小烧杯上。 ②把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织 块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。 ③用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块 ④收集细胞悬液，离心沉淀1000prm，5分钟。 ⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱备用。
研磨法 准备一只70ml组织研磨器 ①将组织剪碎至小块。 ②放入组织研磨器中，加入1-2ml生理盐水。 ③转动研棒，研至匀浆即可。 ④加入生理盐水10-20ml，冲洗研器。 ⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心 沉淀500-800prm，1-2分钟，再用生理盐水洗三 次，离心沉淀。
4. 将粘附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来 , 用 0.25%胰酶消化10－15分钟,室温下,并不断摇震, 以促使细胞脱落下 , 单核细胞的粘附力很强 , 用 酶消化往往获得细胞数少,目前亦采用机械的方 法,用一橡皮刷 , 伸入培养瓶在瓶壁上轻擦 , 将细 胞刮取下 , 但切勿用力过大 , 造成细胞损伤过多。 5. 脱 落 下 来 的 细 胞 移 入 离 心 管 , 离 心 沉 淀 1500prm,5分钟,再以生理盐水漂洗2－3 次,每次 离心800prm,2分钟,以去除碎片杂质。 6.将细胞涂片,以丫啶橙染色,置荧光显微镜下观察 形态和纯度。 7.将细胞以70%乙醇固定,置0-4℃冰箱保存备检。
流式细胞术的样品制备
FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备 技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技 术，FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能 进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性 质对其进行分类的技术。 FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在 FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重 要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细 胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组 织等。
⒊化学试剂处理法
化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用 的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。 试剂配制： ①0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后，加入Hank´s液100ml，封装高压消 毒，置0-4℃保存。 ②胰酶加EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.125%， EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.2%。 各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤既可。
⒊化学试剂处理法
⒈酶消化法
酶对实体组织分散作用原理主要有三方面： ﹡一是可以破坏组织间的胶原。 ﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。 ﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。 酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用 的酶类试剂有： • 蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性 蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞； • 胰酶，能水解脂键和肽键； • 胶原酶，能降解几种分子类型的胶原； • 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键； • 弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤 维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。
二、血液单细胞样品的制备
血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中 的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态， 它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含 有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但 流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象， 因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来， 下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。
㈡ 粒细胞的制备 ⒈用淋巴细胞分离液对细胞进行分层。 ⒉粒细胞的比重较淋巴细胞稍大，因此经分离液分离后 的粒细胞，分层于红细胞之上，分离液的底部。 ⒊以吸管慢慢将粒细胞层吸出，置另一支离心管内，以 5ml的Hank′s液洗涤三次，每次离心沉淀1500prm，10 分钟。 ⒋在吸取粒细胞的同时常附带一些红细胞，因此需将红 细胞去除，加入1.0ml低渗溶液，30-40秒。 ⒌再以Hank′s液洗涤2次，即可获得纯度大于95%以上的 粒细胞。
㈠ 淋巴细胞的制备 ⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理盐水2ml将全血稀释至4ml。 ⒉先将3ml人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将 稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，勿 用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的 分层状态。 ⒊离心2000prm，30分钟，室温18-20℃，离心后可见试 管内的血液清楚的分为4层，上层为血浆层，中层为分 离液层(淋巴细胞所处的位置在血浆层与分离液层中间)， 底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。 ⒋用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另 一支离心管，用生理盐水稀释至10ml，离心洗涤2次， 每次均以1500prm, 10分钟，弃上清后即得到纯度较高 的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。 ⒌70%冰乙醇固定，置4℃冰箱保存。
实验步骤： ①将组织切成薄片放入试管。 ②加入EDTA液5ml，室温，半小时，弃之。 ③加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37℃恒温水浴30 分钟，间断振荡3-5次。 ④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5分 钟，再以生理盐水洗2-3次，离心500-800prm， 1-2分钟。 ⑤70%乙醇固定置冰箱中被检。
㈢ 单核细胞制备 1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理 盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。 2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入 培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。 3.放入37℃恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶 , 将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次, 以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量 的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴 附快的特点 ,而其他细胞没有这个特性,所以利 用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细 胞。
二、实体组织单分散细胞的制备
㈠新鲜实体组织
新鲜实体组织是手术或活检后根据 检测目的而采取的样品，此样品应及时 进行适当的保存处理，如及时用固定剂 或低温对组织进行保存，以避免由于室 温过高、放置时间过长而造成组织自溶， 影响检测结果。
新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：
⒈酶消化法 ⒉机械法
剪碎法 网搓法 研磨法
为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的 选择和影响因素： ※ 酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成 酶效 价降低 ※ 注意组织在消化液中的消化时间 ※注意酶活性的PH值 ※ 注意酶的适用浓度 ※ 随时注意影响酶活性的其他因素 各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免 疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细 胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的， 不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污 染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的 结构或功能产生不利的影响。
⒉机械法 机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或 用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注 射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样 也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液 中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使 用。
常用的几种机械法制备过程如下：
剪碎法：
①将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。 ②用剪刀将组织剪至匀浆状。 ③加入10ml生理盐水。 ④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。 ⑤离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗三次，每 次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。 ⑥以300目尼龙网过滤除去细胞团块。 ⑦70%冰乙醇固定，放入4℃冰箱。
注意事项：
Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放 置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM 测定结果。 Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固 定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。 Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶 剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。 Ⅳ需注意不同的组织选用适当的方法，如富于细胞的肿 瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样 癌以及一些软组织肉瘤)不一定要用酶学或化学法，往 往用单独的机械法就可以收到大量单分散细胞。 Ⅴ在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结 缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原 酶为好，因为胶原酶具有在Ca2＋、Mg 2＋存在或在血清 状态下不发生活性降低的特征。
石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
实验方法： ①石蜡包埋组织。 ③加入二甲苯5-8ml脱蜡(在室温下)，1-2天，视 石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后 弃去二甲苯。 ④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度 的酒精5ml，每步10分钟，去乙醇，加入蒸馏 水3-5ml，10分钟后弃之。 ⑤消化：加入2ml 0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置 37℃恒温水浴中消化30分钟，消化期间每隔10 分钟振荡一次。