MLVA分型技术和实验操作步骤 ppt课件

•等
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3
MLST
• 结果无偏性unambiguous results • 有相应的数据库支持 international databases
• 区分度低，Low discrimination power • 高花费，high cost: sequencing • 不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for
• （二）普通电泳分析
• （三）测序分析
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模板制备： DNA提取模板 水煮模板
MLVA实验步骤-PCR
2个PCR体系/多重PCR体系：
体系ห้องสมุดไป่ตู้
指标
（20ul）
Buff dNTP er
A1
TR2-FAM 2.0 1.5
TR4-HEX
A2
TR1- FAM 2.0 1.5
TR3-HEX
上下游引 酶 物
routine surveillance and epidemiological studies
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4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats
•
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
strain CDC1551 : 230 bp
Gel migration
300 bp
测序分析 200 bp
100 bp
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230 bp 215 bp 200 bp
7
VNTR和等位基因
Primer-F
VNTR 重复
侧翼序列
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18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
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VNTR 位点的确定
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MLVA 实验操作
• 一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板
• 二、PCR 扩增
•
多重PCR反应
• 三、扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳：
•
1.引物标记
•
2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ）
•
3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp
Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
PCR primers:
CTCCPCCACRACCCAGGACAC
• • 图像分析： • 脉冲场凝胶电泳（PFGE) • 随机扩增多态性DNA分析（random amplified
polymorphic DNA，RAPD) • 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length
polymorphism, AFLP） • 核糖体分型（ribotyping）
10uM（个 ul）
0.2
0.3u
0.3
0.2
0.3u
0.3
模板ul Tm
0.7
56℃
0.7
57℃
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延伸时 间
40秒
40秒
循环数 片段大小 判断方式
30
毛细管电泳
30
毛细管电泳
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扩增条带大小判断：
• （一）毛细管电泳： • 1.引物标记 • 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物
（FAM 、HEX 和TAMRA ） • 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST 其他特征
MLVA1型 735 2 MLVA14 1046 15
6 6 2 10 2 3 3 1 36 ST1 + + 3 1.7 1 9 1 2 3 0 26 ST81 - - -
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多位点可变数目串联重复序列 （MLVA）分型技术和操作步骤
李伟
中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室
PulseNet China第一期培训 2010-06-19
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病原菌分子分型的目的
• 长期研究 病原菌的遗传进化
– 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 – 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异
（ABI自带） • （二）普通电泳分析 • （三）测序分析
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用毛细管电泳来判断片段大小
用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图
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MLVA聚类分析
• Bionumerics 软件（version 4.64 ）
• 效用均等的分类资料的分析方法 （ UPGMA） (unweighted pair group method
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分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85 • 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2
• 评价MLVA方法的分辨力：
Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
• 聚类分析 • 构建最小生成树
下游序列
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列
Primer-R
- 重复拷贝数 = 扩增大小 上下游序列
重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数p取pt课整件
8
串联重复序列可变重复数目的判定
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9
MLVA方法
• 多位点可变数目串联重复序列分析 • 可变数目串联重复：VNTR： • MLVA方法：即VNTR的数组 • 例如：
• 短期研究
– 了解病原菌的适应性 – 感染溯源
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2
分子分型方法
• 序列或分类资料为基础的等位基因： • 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST） • 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus
Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA）
using arithmetic averages)