杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究
漆酶的分离纯化及其应用研究
漆酶的分离纯化及其应用研究漆酶是一种生物催化剂，被广泛应用于漆木器、皮革、纺织品、造纸、食品等领域。
漆酶的分离纯化及其应用已经成为当前生物技术领域研究的热点之一。
一、漆酶的分离纯化方法漆酶在微生物中的合成量较少，因此，为了进行漆酶的高效生产和利用，需要对漆酶进行分离纯化。
常见的漆酶分离纯化方法有：超滤法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。
超滤法是通过超滤膜将酶与其他杂质分离，可以得到相对较为纯净的漆酶。
离子交换层析法是利用离子交换树脂将需要分离的物质分离出来。
凝胶过滤层析法则是利用化学性质不同的凝胶将需要分离的物质分离出来。
二、漆酶的应用研究漆酶的应用研究主要集中在以下几个领域：1.漆木器颜色、光泽度的成型漆木器的颜色和光泽度可以通过打磨、上光等方式达到，但这种方法比较费时费力，而且不够持久。
采用漆酶涂料，可以使漆木器的颜色和光泽度更加饱满，而且能够更持久地保持。
2.制作皮革中的保护剂对皮革进行漆酶处理，可以使皮革更加柔软、舒适，同时具有保护作用，可以延长皮革的使用寿命。
3.纺织品整理在染色后，使用漆酶整理纺织品，可以提高纺织品的匀染性和光泽度，使其更加柔软舒适。
4.造纸生产漆酶在造纸生产中也起着重要的作用。
已经有不少研究表明，使用漆酶可以比传统方法更加高效地从纸浆中分离木质素，使得纸张更加柔韧、实心、白度高。
5.食品加工漆酶被广泛应用于味精、酱油等食品加工领域。
将其添加到食品中可以改善食品口感和口感质量。
结语漆酶具有一定的生物技术优势，不仅能够提高生产效率和质量，而且还能够在生态保护方面发挥重要的作用。
不过，需要在其分离纯化和应用研究方面进一步深入探索，以更好地推动其应用。
漆酶提纯分离
漆酶的提取纯化及其脱色研究摘要【目的】本实验通过选取一株突变的高产漆酶的粗毛栓菌发酵液〔培养11天产生漆酶酶活最高〕，经过离心沉淀过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，别离纯化漆酶以及测定其纯化相关参数，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各步别离后的成分变化。
最后研究其脱色的效果，为漆酶应用的相关研究提供实验依据。
【方法】利用过滤，硫酸铵沉淀，Sephadex G-75凝胶过柱层析，的方法提取纯化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定别离成分，并用光密度测漆酶的脱色率。
【实验材料】发酵液，相关试剂【预计结果】选用凝胶浓度为12%，结果可以明显看出，经过纯化的漆酶的条带是单一的，相关参数〔蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数〕比拟高，另外，脱色效果比拟显著。
【结论】关键词漆酶纯化脱色应用1 前言1.1 实验的研究意义木质素是植物中产生的一类难于降解的高分子化合物的统称，主要由苯丙烷单元通过醚键和碳键等多种共价键连接而成的杂聚物，是自然界中碳循环的限速环节之一。
其降解主要由微生物完成，这类微生物主要包括真菌、放线菌和细菌。
其中白腐真菌〔white rot fungi〕被认为是生物圈中植物天然高分子物质木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，能使这些物质最终分解为二氧化碳和水。
白腐真菌通常通过分泌木质素过氧化物酶〔Lignin peroxidase，Lip〕、锰过氧化物酶〔Manganese peroxidase，MnP〕和漆酶〔Laccase，Ec.2〕三种主要的木质素降解酶类来降解木质素。
其中漆酶，能够将木质素降解为CO2和H2O，反响过程不需要H2O2的参与，在木质素降解中起主要作用。
其中漆酶〔Laccase〕是一种多酚氧化酶〔p-diphenol oxidase EC..2〕，属于蓝色氧化酶家族。
漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。
因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质能源等领域具有广阔的应用前景，利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用，进展合理的开发利用，可减少化学药品的使用量，降低生产本钱和保护环境。
《云芝多糖提取、纯化、单糖组成分析及体外抗氧化活性的研究》
《云芝多糖提取、纯化、单糖组成分析及体外抗氧化活性的研究》一、引言随着现代生活节奏的加快，环境污染和不良的生活习惯使得抗氧化成为了健康领域的重要议题。
云芝作为一种富含多糖的天然生物资源，其多糖成分具有显著的生物活性，尤其在抗氧化方面表现出潜在的应用价值。
本文旨在研究云芝多糖的提取、纯化过程，分析其单糖组成，并探讨其体外抗氧化活性，为云芝多糖的进一步应用提供理论依据。
二、材料与方法2.1 材料云芝样品采自特定产地，经过干燥处理后备用。
实验中所用试剂均为分析纯。
2.2 方法2.2.1 云芝多糖的提取（1）云芝样品的预处理；（2）采用热水浸提法提取云芝多糖；（3）提取液经过浓缩、干燥，得到云芝多糖粗品。
2.2.2 纯化（1）采用乙醇沉淀法对粗品进行初步纯化；（2）利用透析法进一步纯化多糖；（3）通过凝胶渗透色谱法对纯化后的多糖进行分级。
2.2.3 单糖组成分析（1）采用酸水解法将多糖水解为单糖；（2）利用离子交换柱层析法对单糖进行分离；（3）通过高效液相色谱法测定单糖的含量及比例。
2.2.4 体外抗氧化活性测定（1）采用DPPH自由基清除实验评估抗氧化能力；（2）通过ABTS自由基清除实验验证抗氧化效果；（3）分析云芝多糖对超氧阴离子自由基的清除作用。
三、结果与讨论3.1 云芝多糖的提取与纯化通过热水浸提法和一系列纯化步骤，成功提取并纯化了云芝多糖。
在纯化过程中，我们发现适当的乙醇浓度和透析时间对纯化效果具有显著影响。
此外，凝胶渗透色谱法可有效将多糖分级，为后续研究提供了纯净的多糖样品。
3.2 单糖组成分析经过酸水解、离子交换柱层析和高效液相色谱法分析，确定了云芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等单糖组成。
各种单糖的比例因云芝品种和生长环境的不同而有所差异，这为进一步研究云芝多糖的结构和功能提供了依据。
3.3 体外抗氧化活性研究实验结果表明，云芝多糖具有显著的体外抗氧化活性。
在DPPH自由基清除实验和ABTS自由基清除实验中，云芝多糖表现出较强的抗氧化能力，能够有效地清除超氧阴离子自由基。
云芝菌丝球在流化床反应器中产漆酶的研究
云芝菌丝球在流化床反应器中产漆酶的研究
高恩丽;张树江;夏黎明
【期刊名称】《浙江大学学报（工学版）》
【年(卷),期】2006(040)003
【摘要】为了提高云芝菌发酵生产漆酶的效率,提出了一种利用自絮凝菌丝球在流化床生物反应器中重复分批发酵产漆酶的新方法.采用流化床生物反应器中所得漆酶对含靛蓝的染整废水进行脱色研究.在优化后的产酶条件下,考察苯酚的添加浓度对漆酶活力的影响,并通过在培养基中添加苯酚诱导物进行漆酶多批次培养.研究结果表明,重复8批产酶的平均漆酶活力高达694.733单位/mL.此方法所得漆酶对染料靛蓝具有明显的脱色降解作用,当酶用量为2.78单位/mL废水,反应40min,脱色率达96.5%.该方法采用的流化床生物反应器性能稳定、菌丝球可重复使用,该方法有利于漆酶的高效、规模化生产.
【总页数】4页(P533-536)
【作者】高恩丽;张树江;夏黎明
【作者单位】浙江大学,化学工程和生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程和生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学,化学工程和生物工程学系,浙江,杭州,310027
【正文语种】中文
【中图分类】TU196.4
【相关文献】
1.杂色云芝漆酶粗酶液对对苯二酚的降解及动力学分析 [J], 汪伦记;李爱疆;吴坤;翟旭丽
2.云芝漆酶粗酶液在造纸废水深度处理中的应用研究 [J], 徐化强;冯晓静
3.中药药渣发酵生产毛云芝菌漆酶培养基的工艺研究 [J], 岳鹍;潘志恒;孙勇民
4.云芝漆酶粗酶液降解2-氯苯酚的研究 [J], 刘巧;赵建;李雪芝;万广远;曲音波
5.云芝漆酶同工酶的分离纯化及酶学性质 [J], 郭伟云;汤祥忠;姚朝阳;邵强;李宗义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
杂色云芝菌生产漆酶的发酵条件优化及漆酶的应用研究
浙江工业大学硕士学位论文
杂色云芝菌生产漆酶的发酵条件优化及漆酶的应用研究
摘要
漆酶作为一种可以在食品、造纸、环保等多个工业领域中发挥作 用的生物酶，其应用前景非常好。但是漆酶的产量较低，无法充分发 挥其优势。 因此，首先对杂色云芝菌（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）纯种培养生产漆
ＩＶ
浙江工业大学硕：｝学位论文
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈａｎ
ＡＢＴＳ（６．０
ｋｍａ０１），ｖａｎｉｌｌｉｎ（２．０岬０１）ｍｉｘｅｄ
ｗｉｔｈ
ＡＢＴＳ（１．２ Ｉ．ｔｍ０１）ａｓ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｇｏ
ｂｌｕｅ．Ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｈａｒｄｌｙ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚｅ ｄｙｅｓ，ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ａｄｄｅｄ
分子的碳水化合物部分（占蛋白质分子重量的１０％．４５％）；即使是同一菌株， 产生的漆酶异构体其分子量也可能不同；真菌漆酶的分子量在５９
ｋＤ．８０
ｋＤ之间，
皆为糖蛋白，含糖量３％．５％不等，其中包括己糖胺、葡萄糖、半乳糖、阿拉 伯糖等，漆酶多为单体酶，等电点ｐＩ １．１．２漆酶的结构及其催化机理 漆酶分子中一般含有４个铜原子，根据磁学和光谱学特征，可将这它们分为
ｔｏ
ｉｍｐｒｏｖｅ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ
ｎｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｇｏ ｂｌｕｅ ｂｙ ｌａｃｃａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｕｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ Ｃ．ｒｕｇｏｓａ． Ｌａｃｃａｓｅ，ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ｏｆ ｂｏｔｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｄｅｎｉｍ ｗａｓｈｉｎｇ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｅｒｅｌｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｅ ｕｓｅｄ，ｔｈｅ
用于烟梗木质素降解的漆酶的分离纯化研究
用于烟梗木质素降解的漆酶的分离纯化研究张锐;李元实;寇霄腾;朱良华;余翔;马林【摘要】通过云芝菌发酵得到的漆酶粗酶液经超滤浓缩后，以硫酸铵为盐析剂进行分级盐析沉淀，利用DEAE－Sepharose－F．F．柱层析对漆酶的发酵液进行分离纯化．SDS－PAGE电泳分析证明获得了电泳纯漆酶，其分子量约为64．4 kD．分离纯化过程中酶被纯化了22．80倍，酶活的回收率为36．32％，表明云芝菌产漆酶得到了很好的分离纯化．将漆酶液用于烟梗木质素的降解，实验结果表明，经此降解处理过的烟梗其内在品质得到了一定的提高：杂气和刺激性明显降低，木质气明显减弱，香气和余味均有改善．%After the laccase crude enzyme which was obtained by fermenting Coriolus versicolor had been concentrated and hyperfiltrated,grading salting precipitation and DEAE-Sepharose-F.F.column chromatog-raphy had been taken to separate and purify the laccase fermented liquid with ammonium sulfate as the sal-ting-out agent.SDS-PAGE electrophoresis results showed that pure laccase could be obtained,the molecular weight was about 64.4 kD,enzyme was purified for 22.80 times by the purification process,the enzyme ac-tivity recovery rate was 36.32%.These proved that the laccase which was produced by Coriolus versicolor could be well ing the enzyme solution in the experiment stem lignin degradation,the results showed that the intrinsic quality of the processed tobacco stems had been improved to some extent,miscel-laneous gases and irritating significantly reduced,wood gas also significantly reduced,aroma and aftertaste slightly improved.【期刊名称】《郑州轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P5-8,12)【关键词】烟梗木质素;漆酶;分离纯化;云芝菌【作者】张锐;李元实;寇霄腾;朱良华;余翔;马林【作者单位】郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001; 云南中烟再造烟叶有限责任公司技术中心，云南昆明 650000;吉林烟草工业有限责任公司生产技术中心，吉林延吉 133000;安徽中烟工业有限责任公司原料研究部，安徽蚌埠 233000;吉林烟草工业有限责任公司生产技术中心，吉林延吉 133000;郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001;郑州轻工业学院烟草科学与工程学院，河南郑州 450001【正文语种】中文【中图分类】TS41+30 引言烟梗的主要成分是细胞壁物质,如纤维素、半纤维素、木质素以及多糖等.烟梗中的木质素对烟草内在品质及风味有不利影响，抽吸时会产生多种有害成分，故烟梗在卷烟产品中的应用受到了很大的限制.从烟梗中分离木质素，运用漆酶对其进行降解，可改善烟梗的品质.漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶，与植物抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋白家族[1].它最早在日本紫胶漆树的渗出液中被发现[2]，后在真菌中被发现[3-4]，在白腐菌中普遍存在，少数低等真菌和植物中也产生漆酶[5].目前,使用较广泛的产漆酶菌株有杂色云芝菌(Coriolus versicolor)、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)等.在纯系培养中漆酶能有效地将木质素分解为CO2和H2O，但由于漆酶发酵周期长、原料成本高、酶活力较低，因而此种分解方法还未能实现大规模的工业化生产.为了更好地利用云芝菌产漆酶，本文拟通过研究漆酶粗酶液经过分离纯化后的酶活力变化情况，将纯化的漆酶应用于烟梗木质素的降解，从而改善烟梗品质，提高烟梗在卷烟中的使用价值.1 材料和方法1.1 实验仪器和材料菌种：云芝菌由郑州轻工业学院生物实验室保存，菌丝体于4 ℃保存在PDA斜面培养基上.材料：牛肉膏、蛋白胨、琼脂等(生化试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司产；氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、硫酸铵等(AR 级)，天津大茂化学试剂厂产；葡萄糖,广东汕头市西陇化工厂产.PDA固体培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4·7H2O 500 mg/L，ZnSO4 500 mg/L，琼脂 20.0 g/L.PDA液体产酶优化培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 5.0g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4·7H2O 500 mg/L，ZnSO4 500 mg/L，CuSO4 1.0 mmol/L，维生素B1微量.测酶活试剂：0.5 mmol/L的2,2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液；醋酸-醋酸钠酸缓冲溶液(pH=4.5).实验仪器见表1.表1 实验仪器1.2 实验方法1.2.1 漆酶粗酶提取液的制备将保藏的云芝菌种转接于固体的PDA培养基上，于30 ℃下培养6 d.将生长得到的菌丝平面制成直径约为10 mm的菌片，然后在无菌条件下将3块菌片接入发酵培养基.在云芝菌液体发酵产漆酶的最适发酵条件下(摇床转速150 r/min,初始pH=5.0，发酵温度28 ℃)培养 7 d，取发酵液于离心管中，在12 000 r/min下离心10 min，得到上清液，即为粗酶液.1.2.2 漆酶酶活力和蛋白质含量的测定在一定条件下，1 min氧化1.0 μmol的底物所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U).实验以ABTS(0.5 mmol/L)为底物，于25 ℃，在2.5 mL缓冲液(0.1 mol/L 醋酸-醋酸钠，pH=4.5)中加入 0.4 mL ABTS，然后加入0.1 mL的粗漆酶液体启动反应，在 420 nm 下测定3 min内吸光值的变化，以按照同样方法处理加热失活的酶液作空白对照.蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝R-250比色法[6].1.2.3 漆酶粗酶液的超滤浓缩在最佳的发酵条件下制得300 mL粗酶液，并在4 ℃,10 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液用0.22 μm的滤膜过滤，然后在4 ℃下进行超滤浓缩，直至体积为 150 mL 左右.1.2.4 硫酸铵分级沉淀准确量取100 mL漆酶粗酶液，缓慢加入研磨的硫酸铵粉末，缓慢搅拌至其完全溶解，取少量上清液和沉淀，测定酶活和蛋白质含量.每隔10%为1个硫酸铵饱和样点，确定沉淀所用的最佳饱和浓度.在粗酶液中加入硫酸铵饱和溶液至饱和度为40%，缓慢搅拌至混合均匀，然后在4 ℃下静置4 h，使蛋白质充分沉淀.在4 ℃,18 000 r/min 的条件下离心20 min，取上清液.在上清液中继续加入硫酸铵粉末至二级饱和度，缓慢搅拌至均匀，4 ℃静置过夜，离心后收集沉淀溶于 20 mL 乙酸钠缓冲液(10 mmol/L,pH=4.5)中，在4 ℃ 环境下保存备用. 1.2.5 透析将透析袋(透析膜截留相对分子质量为1.5×103)剪成15 cm长的片断放入盛有2%碳酸氢钠和1 mmol 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液的烧杯中煮沸10 min.然后用蒸馏水洗涤后再煮沸 10 min，将冷却后的透析袋浸入蒸馏水中，在4 ℃下存放于95%乙醇中备用.将适量的酶液装入透析袋，放入蒸馏水中透析24 h，每隔6 h更换1次缓冲液.1.2.6 酶液浓缩在透析袋外涂布聚乙二醇粉末，放置冰箱内片刻后取出，然后更换干燥的聚乙二醇粉末继续浓缩，直至酶样品体积浓缩到5 mL左右.1.2.7 酶液DEAE-Sepharose-F.F.离子交换层析及分子量的测定将经过透析、浓缩后的酶液上样于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱(3.0 cm×20 cm)，然后用0.1～0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为2.0 mL/min.用自动分步收集器收集洗脱液，每管收集4 mL，检测每管洗脱液的蛋白质含量及酶活力，收集具有酶活力的组分洗脱液并将收集的酶液透析、浓缩后，在4 ℃ 条件下保存备用.采用SDS-PAGE电泳检测漆酶的纯度及分子量[6].分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%.电泳条件为恒压，浓缩胶80 V，分离胶120 V.电泳后用考马斯亮蓝R-250进行染色.根据标准蛋白Marker在SDS-PAGE中的相对迁移率对相对分子质量作图，求出该漆酶的相对分子质量，测定样品和标准蛋白的相对迁移率Rf值，求得其纯酶的相对分子质量.1.2.8 漆酶降解烟梗中的木质素准确称取2 g烟梗粉末置于三角瓶中，加入酶解液(酶液、缓冲溶液和水)100 mL，每组重复3个平行样，置于恒温振荡培养箱中进行酶解，使烟梗末与酶液充分混合.到达规定时间后取出，过滤处理液并洗净样品，用灭活后的酶解液作为对照，其他处理条件同上.然后用Klason法[7]测定经过酶液处理前后烟梗中木质素含量，并将降解前后的烟梗制成梗丝进行感官评吸鉴定.其中木质素的降解率计算公式为木质素的降解率/%=2 结果与讨论2.1 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀过程中上清液漆酶活力及蛋白质含量的变化情况如图1所示.图1 硫酸铵沉淀上清液漆酶活力及蛋白质含量变化曲线从图1可以看出，当硫酸铵饱和度<30%时，上清液中漆酶活力变化不明显，约44%的蛋白质沉淀下来；当硫酸铵饱和度在40%～60%之间时，上清液漆酶活力迅速下降；当硫酸铵饱和度继续增加时，上清液中漆酶活力变化不大，此时上清液中的漆酶活力已经很低，而在此过程中，上清液中蛋白质含量的变化呈现缓慢下降的趋势.综合硫酸铵分级沉淀过程中漆酶活力和蛋白质含量的变化情况，选取饱和度为40%的硫酸铵为其分级沉淀的一级饱和度.2.2 离子交换柱层析将硫酸铵分级沉淀后的酶液，经过透析和聚乙二醇粉末浓缩至5 mL后，利用DEAE-Sepharose-F.F.层析柱，对漆酶液进行提纯，然后用0.1～0.5 mol/L 的NaCl溶液进行梯度洗脱，结果如图2所示.由于蛋白质在280 nm处有光谱吸收，故利用紫外可见分光光度计在280nm(A280)处测量酶液的吸光值(Abs).由图2可以看出，在整个洗脱阶段出现了两个大小不等的蛋白质峰.检测洗脱液各管的漆酶活力后，结果显示第28#—40#管的蛋白质峰较高，与漆酶酶活峰相一致，表示该蛋白质即为漆酶酶蛋白.2.3 漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白的变化情况漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白变化结果见表2.由表2可知，在漆酶纯化过程中，经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀，以及DEAE-Sepharose-F.F.柱层析的逐级分离后，漆酶粗酶液得到了纯化，且效果较好.在分离纯化过程中漆酶被纯化了22.80倍，酶活的回收率为36.32%.图2 云芝菌漆酶的DEAE-Sepharose-F.F.层析图2.4 漆酶纯度及分子量测定云芝菌漆酶SDS-PAGE电泳图见图3.经过盐析和 DEAE-Sepharose-F.F.柱层析纯化后所得的漆酶为单一区带，说明样品达到电泳纯.根据标准蛋白的相对迁移率对相对分子质量作图，求出该酶的分子量为 64.4 kD.表2 漆酶纯化过程中酶活力及总蛋白变化结果图3 云芝菌漆酶SDS-PAGE电泳图2.5 木质素的降解对烟梗内在品质的影响用酶液对烟梗中的木质素进行降解，结果见表3.将降解前后的烟丝进行感官评吸，结果见表4.表3 烟梗中木质素降解结果 %表4 木质素降解对烟梗内在品质的影响由表3可知，在漆酶的作用下，烟梗中木质素的降解率最高可达16.9%.从表4明显看出，木质素降解后烟梗的内在品质均得到了一定的提高，杂气和刺激性明显降低，木质气明显减弱，香气和余味略有改善.3 结论本文通过超滤浓缩、硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sephaorse-F.F.柱层析、NaCl梯度洗脱等一系列的纯化步骤，对云芝菌产漆酶的分离纯化进行了研究，在分离纯化过程中漆酶被纯化了22.80倍，酶活的回收率为36.32%.SDS-PAGE电泳分析证明，获得了电泳纯漆酶，确定了漆酶的分子量约为 64.4 kD，实验结果显示，云芝菌产漆酶得到了很好的分离纯化.将纯化的漆酶应用于烟梗木质素的降解中，可提高烟梗的可用性，将处理后的烟梗应用到卷烟的生产中，可以在很大程度上提高卷烟制品的品质.本文为烟梗在卷烟制品中的应用提供了较好的理论基础.参考文献:[1] 刘淑珍，钱世钧.担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究[J].微生物学报，2003,43(1):73.[2] Yosiiida H.Chemistry of lacquer(Urusht)[J].Chem Soc,1883,43:172.[3] Bertrand G.Sur la presence simultanee de la laccase et de la tyrosinase dans le suc de quelques champignons [J].C R Hebd Seances AcadSci,1987,123:463.[4] Laborde J.Sur lacasse des vins [J].C R Hebd Seances AcadSci,1896,123:1074.[5] Reinhannar ccase in Copper Proteins and Copper Enzymes[M].Boca Raton Ela:CRC Press,1984.[6] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000:243-260.[7] Ryan S, Schnitzhofer W,Tzanov T,et al.An acid-stable laccase from Sclerotium rolfsii with potential for wool dye decolourization[J].Enzyme and Microbial Technology,2003, 33:766.。
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
灵芝突变株G1502漆酶的分离纯化及酶学性质研究
灵芝突变株G1502漆酶的分离纯化及酶学性质研究王岁楼;王琼波【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2008(029)005【摘要】对灵芝突变株G1502发酵液中漆酶的分离纯化方法及酶学性质进行了初步研究.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析发现,G1502在发酵时只分泌一种漆酶.发酵液经透析浓缩、DEAE-纤维素柱层析,比活力提高 24.28倍,酶活力回收率18.66%.以愈创木酚为底物时该酶的动力学常数K m=1.94×10-4mol/L,Vmax=2.28×10-6 mol/L·min;愈创木酚浓度高时对酶活性有抑制作用.K +对酶有激活作用,Cu2+激活作用不大,Fe 2+、Co2+、Ca2+、Na +、Ba2+对酶活力有抑制作用.【总页数】5页(P287-291)【作者】王岁楼;王琼波【作者单位】中国药科大学食品科学与安全系,江苏,南京,210009;郑州轻工业学院食品与生物工程系,河南,郑州,450002;郑州轻工业学院食品与生物工程系,河南,郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.杏鲍菇菌糠漆酶分离纯化及部分酶学性质研究 [J], 刘骊;单书凯;张杰;闫苗;赖春芬;艾柳英;孙淑静2.灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质 [J], 何国斌;蔡少丽;柯崇榕;黄平;张明亮;黄建忠3.大球盖菇漆酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 钱磊;张业尼;陈雪;刘金福;张志军;刘建华4.灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究 [J], 林卫军;周玉恒;经艳;卫力;覃香香;张厚瑞5.灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质 [J], 王琼波;王福青;赵凤琴;王岁楼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质
毛 云芝 菌 固体 发 酵 产 漆 酶 的 分 离纯 化 及 酶学 性 质
孙 巍 ， 夏 春 雨
与工程 学院 ， 西 南 昌 ３０４ ） 江 ３ ０ ５
，
蔡 和辉 ， 刘 学铭 １ ＊
（ ．广 东省 农业科 学 院 蚕 业与农产 品加 工研 １ 究所 ， 东 广 州 ５ ０ １ ；２ 广 １ ６ ０ ．江 西农 业大 学 生物 科 学
氧 化 ＡＢＴＳ的 Ｋ 为 ０ ０ ３ ｍｍｏ ／ 对 邻 苯 二 酚 的 Ｋ 为 ３ ７ ． ９ ｌＬ， ． １ｍｍｏ／ ｌＬ。
关键 词 ： 云芝 菌 ； 酶 ； 毛 漆 固体 发酵 ； 化 ； 学性质 纯 酶
中 图 分 类 号 ： ２ ． ＴＱ ９ ０ １ 文献标 识码 ： Ａ
ｃ ｌ ｃ ｅ ｆｅ ｏ ｉ ｔ ｔ ｅ ｍｅ ａ ｉ ｎ． Ｔｈｅ １ ｃ ａ ｅ ｗａ ｒｆｅ ｏ ｅ ｅ ｔ ｏ ０ｒ ｔｃ ｈ ｍｏｇ ｎｅｔ ｏｌｅ ｔ ｄ ａ ｔ ｒ ｓ ｌｄ ｓ ａ ｅ ｆ ｒ ｎｔ ｔｏ ａ ｃ ｓ ｓ ｐｕ ｉｉ ｄ ｔ １ ｃ ｒ ｐｈ ｅ ｉ ｏ ｅ ｉｙ ｂｙ ｔ ｅ ｉｌ ｆｓ ｅ ｆｃ ｎｔ ｉｕｇ ｔｏｎ，ｆｌｒ ｔｏ ｈｅ ｓ ｒａ ｓ ｏ ｔ ｐｓｏ ｅ ｒｆ ａ ｉ ｉｔ ａ ｉ ｎ，ａ ｍｍｏｎ ｕｍ ｕ ｆ ｔ ｅ ｉ ｉａ ｉ ｎ，ｉ ｎ ｅ ｃ ｎ ｅ ｉ ｓ ｌａ ｅｐｒ ｃ ｐ ｔ ｔｏ ｏ — ｘ ｈａ ｇ ｃｒ ｈ ｏｍａ ｏ ａ ｈｙ ｏ ｔ ｇｒ ｐ ｎ ＤＥＡＥ— ｅ ａ ｏ ｅ ｆ ｓ ｌ ｗ ｎ ｅ ｉｔ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ａ ｅ １ ０．Ｐｕ ｉｉａ ｉ ｎ Ｓ ｐｈ ｒ ｓ ａ ｔ ｆｏ ａ ｄ ｇ ｌｆｌｒ ｔｏ ｎ ｓ ｐｈ ｄ ｘ Ｇ一 ０ ｒｆｃ ｔｏ
毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质
毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质孙巍;夏春雨;蔡和辉;刘学铭【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2010(029)005【摘要】作者对毛云芝菌利用桑叶和麸皮固体发酵所产漆酶进行了分离纯化,并研究了纯化后漆酶的酶学性质.将毛云芝菌固体发酵漆酶粗提液通过离心、过滤、大孔树脂脱色、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose fast flow层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,结果得到电泳纯的漆酶,纯化倍数15.53,酶活回收率51.21%.用SDS PAGE测得该酶相对分子质量62 600;该酶反应的最适温度为50℃,在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中最适pH值为4.0,在醋酸缓冲液中最适pH值3.0;氧化ABTS的Km为0.093mmol/L,对邻苯二酚的Km为3.71mmol/L.【总页数】7页(P748-754)【作者】孙巍;夏春雨;蔡和辉;刘学铭【作者单位】广东省农业科学院,蚕业与农产品加工研究所,广东,广州,510610;江西农业大学,生物科学与工程学院,江西,南昌,330045;广东省农业科学院,蚕业与农产品加工研究所,广东,广州,510610;江西农业大学,生物科学与工程学院,江西,南昌,330045;广东省农业科学院,蚕业与农产品加工研究所,广东,广州,510610;江西农业大学,生物科学与工程学院,江西,南昌,330045;广东省农业科学院,蚕业与农产品加工研究所,广东,广州,510610【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.利用桑叶和麸皮固体发酵毛云芝菌产漆酶的培养基优化研究 [J], 孙巍;蔡和晖;吴娱明;陈智毅;邹宇晓;施英;刘学铭2.毛云芝菌漆酶的分离纯化和性质研究 [J], 范文霞;蔡友华;刘学铭;肖更生;陈卫东;吴娱明3.毛栓菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 关艳丽;华霜;赵新海;张庆华;钟丽娟;朱巍巍;吴红艳4.云芝漆酶同工酶的分离纯化及酶学性质 [J], 郭伟云;汤祥忠;姚朝阳;邵强;李宗义5.毛柄金钱菌产漆酶固体发酵条件及其酶液对稻草木素降解的研究 [J], 刘梦茹;付时雨;詹怀宇;刘浩;伍红;骆娴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究
灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究
韩君莉;郭丽琼;郑晓冰;周伟坚;林俊芳
【期刊名称】《应用与环境生物学报》
【年(卷),期】2008(14)1
【摘要】采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex
G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化，得到电泳纯漆酶．SDS-PAGE电泳结果显示，该漆酶表观分子量为62×10^3．Native-PAGE 鉴定该漆酶由一种同工酶组成，为单体酶．试验结果表明，该漆酶的最适反应温度为60℃，与ABTS的最适反应pH为4．5，Km为0．188mmol／L，在
pH6．0～8．0之间较稳定．Fe^2＋、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用，EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用．
【总页数】5页(P99-103)
【关键词】灵芝;漆酶;纯化;酶活
【作者】韩君莉;郭丽琼;郑晓冰;周伟坚;林俊芳
【作者单位】华南农业大学生物质能研究所;华南农业大学食品学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q554
【相关文献】
1.韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质 [J], 陈琼华;周玉萍;陈晓;柯德森;程惠贞;田长恩
2.灵芝突变株G1502漆酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 王岁楼;王琼波
3.灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质 [J], 何国斌;蔡少丽;柯崇榕;黄平;张明亮;黄建忠
4.灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究 [J], 林卫军;周玉恒;经艳;卫力;覃香香;张厚瑞
5.灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质 [J], 王琼波;王福青;赵凤琴;王岁楼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《云芝多糖提取、纯化、单糖组成分析及体外抗氧化活性的研究》
《云芝多糖提取、纯化、单糖组成分析及体外抗氧化活性的研究》摘要：本研究旨在探究云芝多糖的提取、纯化工艺，分析其单糖组成，并对其体外抗氧化活性进行评估。
通过科学实验和数据分析，为云芝多糖的进一步应用提供理论依据。
一、引言云芝是一种珍贵的药用真菌，其多糖成分具有显著的生物活性。
多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种生物效应，因此对云芝多糖的提取、纯化及活性研究具有重要意义。
本文通过实验研究，对云芝多糖的提取工艺、纯化方法、单糖组成及体外抗氧化活性进行了系统性的探究。
二、材料与方法1. 材料云芝子实体，实验所用化学试剂均为分析纯。
2. 方法（1）多糖提取：采用热水浸提法提取云芝中的多糖。
（2）纯化处理：通过醇沉法、透析法等步骤对提取的多糖进行纯化。
（3）单糖组成分析：利用高效液相色谱法（HPLC）对纯化后的多糖进行单糖组成分析。
（4）体外抗氧化活性检测：采用DPPH自由基清除法等体外抗氧化实验评价多糖的抗氧化活性。
三、结果与分析1. 多糖提取与纯化通过热水浸提法成功提取云芝中的多糖，经过醇沉法、透析法等步骤的纯化处理，得到较为纯净的多糖样品。
2. 单糖组成分析利用HPLC对纯化后的多糖样品进行单糖组成分析，结果表明云芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖等单糖组成。
3. 体外抗氧化活性检测通过DPPH自由基清除法等体外抗氧化实验评价云芝多糖的抗氧化活性，结果显示云芝多糖具有显著的抗氧化能力，能够有效清除DPPH自由基。
四、讨论本研究通过系统性的实验研究，成功提取、纯化了云芝多糖，并对其单糖组成及体外抗氧化活性进行了评估。
研究结果表明，云芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖等单糖组成，具有显著的抗氧化能力。
这一研究为云芝多糖的进一步应用提供了理论依据。
在多糖的提取和纯化过程中，我们采用了热水浸提法和醇沉法、透析法等常用方法，这些方法的合理运用对于提高多糖的提取率和纯度具有重要意义。
在单糖组成分析中，我们利用HPLC 技术对多糖进行了精确的分析，为进一步研究多糖的结构和功能提供了基础数据。
云芝漆酶的分离纯化和理化性质及抗增殖活性
云芝漆酶的分离纯化和理化性质及抗增殖活性马茜茜;李淼;王贺祥【期刊名称】《食用菌学报》【年(卷),期】2010(017)002【摘要】采用DEAE-cellulose, CM-cellulose和 Q-Sepharose离子交换层析和Superdex 75 凝胶过滤层析,从云芝(Coriolus versicolor)发酵液中纯化得到了一种漆酶, SDS-PAGE 电泳检测其为单一蛋白,分子量为67 kDa,N-端部分氨基酸序列为GIGPVADLTITNAAV.该酶可以催化氧化多种底物,其中对ABTS[ 2,2,-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)]的催化作用最强.最适反应条件为40 ℃, pH 5.0,其活性可以被Cu2+ 激活,被Fe3+、Hg2+、Fe2+抑制.该酶对HIV-1逆转录酶、乳腺癌MCF7细胞和肝癌HepG2细胞均具有抑制作用,其IC50 分别为1.5 μmol/L、2.3 μmol/L 和4.4 μmol/L.【总页数】9页(P43-51)【作者】马茜茜;李淼;王贺祥【作者单位】中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室,北京,100193;中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室,北京,100193;中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室,北京,100193【正文语种】中文【相关文献】1.毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质 [J], 孙巍;夏春雨;蔡和辉;刘学铭2.毛云芝菌漆酶的分离纯化和性质研究 [J], 范文霞;蔡友华;刘学铭;肖更生;陈卫东;吴娱明3.云芝漆酶的培养和分离纯化的研究 [J], 丁少军;宋美静4.云芝漆酶同工酶的分离纯化及酶学性质 [J], 郭伟云;汤祥忠;姚朝阳;邵强;李宗义5.云芝漆酶理化性质及动力学研究 [J], 邵强;姚朝阳;郭伟云;李宗义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
杂色云芝菌产漆酶的发酵优化及其对污染物的降解
杂色云芝菌产漆酶的发酵优化及其对污染物的降解摘要：据相关研究表明，杂色云芝和杂色云芝漆酶具有较强的降解能力，适用于很对不同类型的环境污染物。
研究结论显示，杂色云芝进行液体发酵处理后，在三天内能够对一定浓度的苯胺进行显著的降解，相应的讲解率达到了10%以上;对更高浓度的联苯胺降解效果更为显著上:同时还可以降解硝基苯，对应的降解率更高，约有50%左右，对50mg/L 到200mg/L2，4-二硝基氯苯的实际降解率最高可达90%.相关实验表明，杂色云芝可以对黄曲霉毒素的污染进行降解，具体表现为阳性的玉米样品，一定时期的去毒率能够实现百分之百，这在国内算是首例针对白腐菌对黄曲霉毒素降解的相关研究。
关键词：白腐真菌，杂色云芝，漆酶，环境污染物，降解。
1、引言关于漆酶的研究已经进行了一百多年，在不同的领域中都有涉及，经过深入的研究和探索，已经形成了稳定的研究体系和理论系统，在不同方面的研究中，最受重视的是漆酶对木质素降解的功能。
伴随着研究的进行，漆酶的降解功能受到了众多学者和专家的重视，其在纸浆生物漂白、废水处理以及污染物质降解领域取得了不错的效果，具有重要的研究价值和潜力。
2、白腐真菌降解环境污染物的研究进展2.1白腐真菌生物学背景从分类学角度来说，白少离真菌属于担子菌纲的范畴。
主要生存在北美的一些国家，国内暂时没有发现。
菌丝体一般为多核的结构，通常没有隔膜，呈现出无锁状联合的形态。
2.2降解的主要酶系统产生H2O2的氧化酶:具体的酶系统中，存在于细胞内的葡萄糖氧化酶和存在于细胞外的乙二醛氧化酶，通过与分子氧的结合和反应，对底物进行氧化，从而形激活过氧化氢酶，预示着酶系统的正式启动，进行相关的循环反应。
需H2O2的过氧化物酶和锰过氧化物酶的形成过程中一般在细胞内进行，然后通过分泌系统进行移动。
2.3白腐真菌降解污染物的机理目前存在的关于白腐真菌降解能力的研究，主要涉及黄孢原毛平革菌，并以此为模式菌实施。
经过研究和实验发现，白腐真菌对污染物的降解相对来说比较复杂，可以看作是生物学机制和化学反应的融合。
灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质
芝 Ｅ Ｍ 一 ０发 酵液 进 行 分 离 纯化 ， Ｉ ４ 获得 纯化 漆 酶 ， 化倍 数 为 １． ， 收 率 为 ５ ３ 。Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 纯 ４６ 回 ．％ Ｄ Ａ Ｅ银 染 的 结 果 为 单
一
为催化底物进行酶 学性质研 究， 最适 ｐ Ｈ分别为 ４ ８和 ４ ５ 最适 温度分 别为 ５ ． ．， ５和 ５ ０℃ ， ２种底 物在ｐ ． Ｈ４ ０—５ ０ ．
摘
要： 采用冻干浓缩、 Ｎ ４ ２Ｏ 盐析 、 ｉ ｒｐｐｅｙ（ Ｆ 疏 水层析和 Ｑ Ｓｐ ａｏｅＦｓ Ｆ ｗ 离子 交换 层析对 灵 （ Ｈ ）Ｓ ４ Ｈ ａ ｈｎｌ Ｆ ） Ｔ ｅｈｒｓ ａｔ ｌ ｏ 条 带， 相对分子质量约为 ６ ５ ．３×１ ０ 。以愈创木酚和 ２， 联氮一 （ 乙基一 ２一 二 ３一 苯并噻唑一６一 酸 ） 磺 二铵 盐 （ Ｂ Ｓ ＡＴ）
灵 芝 Ｅ Ｍ 一４ ｌ ０漆 酶 的分 离 纯 化 及 酶 学 性 质
何 国斌 ， 蔡少 丽 ， 崇榕 ， 柯 黄 平 ， 张明亮 ， 黄建 忠
（ 福建 师 范大 学 生命 科 学学 院 福建 省现代 发 酵技术 工程研 究 中心 工 业微 生物教 育部工 程研 究 中心 ， 州 ３ ０ ０ ） 福 ５ １ ８
ａ ａ ｏ ｉｍ ｓｌ ｔ ｐｅ ｉｉｔ ｎ ｉｒｐ ｐ ｅ ｙ （ Ｆ ｙ ｒｐ ｏｉ ｃ ｒｍ ｔ ｒｐ ｙａ ｄ Ｑ Ｓ ｐ ａｏｅ ｌ ｍｍ ｎｕ ｕ ａ ｒｃ ｔ ｉ ，Ｈ Ｔａ ｈ ｎｌ Ｆ ）ｈ ｄｏ ｈｂｃ ｈｏ ａｏ ａ ｈ ｎ ｅ ｈ ｒ ｆｅ ｐ ａｏ ｇ ｓ
ｃｕ ｅ ５ ｌ ｄ ５℃ ａ ｄ ５ ｎ ０
ｏ ａ ｔ ｎ ｔｍｐ ｒ ｔ ｒ ｎ Ｈ ． ｎ Ｈ ． ．Ｗ ｈ ｎ ｔ ｅｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ａ ｅｏ ｆ ｅ ｃｉ ｅ ｅ ａｕ ｅ ａ ｄ ｐ ４ ８ ａ ｄ ｐ ４ ５ ｒ ｏ ｅ ｈ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｗБайду номын сангаасｓｂ ｌｗ
杂色云芝突变株酶活力变化及遗传特性研究
木材 上 留下 白色海 绵状纤 维 素团块 、 白色孔 穴 或斑 纹 ， 自然 界 中降解 木 质 素 的主 要 微 生 物 ． 究 表 是 研
明， 白腐 菌在 诸如 印 染 、 药和 制 浆 造 纸 等 的 废 水 农 处 理等 方 面有着 广 泛 的应 用【 ］具 有广 阔 的应 用 １ ， 前景 ． 白腐菌 的独 特 降解 能 力 ， 要 来 源 于 其 所 产 主 生 的特 殊酶 类 即木质 素过 氧化 物酶 、 锰依 赖过 氧 化
维普资讯 http:Biblioteka /４ ０卷 第 ２ｊ ９ Ｊ
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河 南 农 业 大 学 学 报
Ｊｕ ｎ ｌ ｆＨｅ ａ ｇｉｕｔｒｌ ｉｅｓｔ ｏ ｒａ ｏ ｎ ｎ Ａ ｒ ｌ ａ Ｕｎｖ ｒｉ ｃ ｕ ｙ
Ｖ ． ０ Ｎｏ． ｏ１４ ２ Ａｐ ． ｒ ２０） １ ６
在遗 传差异．
关 键 词 ： 色云 芝 ； 酶 ； 活 力 ；Ａ Ｅ Ｒ Ｐ 杂 漆 酶 ＰＧ ；Ａ Ｄ 中闰 分 类 号 ： ３ ． Ｑ９９９ 文献标识码 ： Ａ
Ｓ ｕ ｉｓｏ ｚ ｍ ｅ Ａｃｉ ｉｙ Ｃｈ ｎｇ ｓａ ｄ Ｇｅ ｅ ｃ Ｃｈ ｒ ｃｅ ｉｔｃ ｔ ｄ ｅ ｎ Ｅｎ ｙ ｔｖｔ ａ ｅ ｎ ｎ ｔ ａ ａ ｔ ｒｓ ｓ ｉ ｉ ｏ ｒｏ ｕ ｅ ｓｃ ｌｒ Ｍ ｕ ａ ｅ ｔ ａ ｎ ｆ Ｃｏ ｉ ｌｓ ｖ ｒ ｉｏ ｏ ｔ ｔｄ Ｓ ｒ ｉ ｓ
摘 要 ： 出发 菌株 相 比较 ， 变 菌株 产 酶 时 间 缩 短 ， 活 力 显 著 提 高 ． 丙烯 酰 胺 凝 肢 电 泳 显 示 ， 变株 发 酵液 蛋 和 突 酶 聚 突
白的种 类增 多， 表达量提 高， 这表 明突 变株 的遗传物质发 生 了变化 ． Ａ １分析进一步证 明， 变株和 出发 菌株 存 ＲＰ ） 突
漆酶纯化及部分性质研究
漆酶纯化及部分性质研究代海兵;王菡【期刊名称】《牡丹江医学院学报》【年(卷),期】2008(29)6【摘要】目的:研究三色革裥菌(Lenzites tricolor)所产漆酶的纯化及其部分酶学特性.方法:利用盐析、层析等方法纯化漆酶;测定漆酶的活力及不同金属离子对其的影响.结果:培养第6d时生长最快,漆酶活力最强.层析缓冲体系应选择:缓冲液Na2HPO4-C6H8O7;pH值5.0;反荷离子强度范围0.4~0.5 mol/L较合适.漆酶的Km值约为60.4 μmol/L.Na+ 、Ba2+对漆酶活力无明显影响,Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+对漆酶有不同的抑制作用,而Ca2+对漆酶有明显的激活作用.经75% (NH4)2SO4盐析、Sephadex G-150层析后得到较好的纯化漆酶.结论:三色革裥菌所产漆酶经盐析、层析得到较好的纯化效果,不同金属离子对漆酶活力具有不同的影响.【总页数】4页(P23-26)【作者】代海兵;王菡【作者单位】牡丹江医学院,黑龙江,牡丹江,157011;生命人寿保险股份有限公司,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】R37【相关文献】1.杏鲍菇菌糠漆酶分离纯化及部分酶学性质研究 [J], 刘骊;单书凯;张杰;闫苗;赖春芬;艾柳英;孙淑静2.烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究 [J], 王剑锋;王璋;饶军;李江;白涛3.灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究 [J], 林卫军;周玉恒;经艳;卫力;覃香香;张厚瑞4.香菇漆酶的纯化及部分性质研究 [J], 王方忠;朱启忠;董学卫;林金飞;曲悦文;徐国英5.彩绒革盖菌CV-8胞外漆酶的诱导、纯化及部分性质研究 [J], 朱启忠;赵宏;韩晓弟;张法忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
灵芝漆酶及部分胞外酶研究的开题报告
灵芝漆酶及部分胞外酶研究的开题报告1. 研究背景灵芝是一种具有重要药用价值的中草药材，其主要有效成分包括多糖、三萜类和酚类化合物等。
其中，灵芝多糖和三萜类化合物在药理上表现出了显著的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等生物活性。
随着对灵芝药用价值的认识逐渐加深，越来越多的研究关注灵芝的生物活性成分。
在灵芝中，一些酶类活性也受到了广泛的关注，其中灵芝漆酶及其部分胞外酶是重要的研究对象。
2. 研究目的本研究旨在系统分析灵芝中漆酶及部分胞外酶的酶活性和酶学特性，探究这些酶在灵芝中的生理功能和药用价值。
3. 研究内容和方法3.1 试验材料本研究选用优质的灵芝浸膏为实验材料，通过分离纯化和酶学检测分析灵芝漆酶及部分胞外酶的酶活性和特性参数。
3.2 实验方法（1）灵芝漆酶的提取与分离纯化：首先将灵芝浸膏经过初步处理，然后采用超声波辅助萃取法提取漆酶，并经过离子交换层析、凝胶层析、纤维素层析等技术进行纯化。
（2）部分胞外酶的提取与分离纯化：首先将灵芝浸膏通过胶体保护层析技术提取部分胞外酶，并经过凝胶层析和疏水层析等技术进行纯化。
（3）酶学检测方法：分别使用紫外分光光度计、酶标仪等设备检测灵芝漆酶和部分胞外酶的最适pH、最适温度、酶活性等酶学特性参数。
4. 研究预期结果本研究的预期结果包括：（1）成功提取和分离出灵芝漆酶及部分胞外酶。
（2）鉴定并比较灵芝漆酶及部分胞外酶的酶学特性参数。
（3）探究灵芝漆酶及部分胞外酶的生理功能和药用价值。
5. 研究意义本研究将为深入研究灵芝中酶类活性和药用价值提供重要的理论参考，为灵芝相关产品开发和制造提供技术支持，对于推动灵芝产业的发展和提升其市场价值具有重要意义。
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表 1 LacA 纯化了 9.30 倍 得率为 18.2% LacB 纯化了
3.41 倍 得率仅 0.2% LacB 的提纯倍数小于 LacA 得率也远低于 LacA
表 1 杂色云芝漆酶的提纯和得率 Table 1 Purification of laccase from C. versicolor
7% 内含 2%两性电解质 Pharmalyte(pH 3~10) 聚焦在 10 左右进行 将电源的电压 电流和功率
最高值分别限定为 1500V 25mA 和 15W 聚焦 2h 后 从凝胶两边截下 1cm 宽的胶条 切成 0.5cm
小段 用 3mL 经抽气的蒸馏水浸泡 10h 测定 pH 并绘 pH-距离图 余下的凝胶固定 染色
与愈创木酚反应而着色的蛋白质带即为漆酶带
2.3.8 温度对酶活的影响
10mL 反应液中含 5mmol⋅L−1 琥珀酸缓冲液(pH 4.5) 1mL, 酶液 0.1mL, 4mmol⋅L−1愈创木酚 1mL, 分
别在 15~100 水浴条件下反应 30min 测定酶活
2.3.9 酶的热稳定性试验
LacA 和 LacB 两酶活分别在 20~100 水浴中放置 2h, 冷却后加入底物 测定酶活力 以不保温
也都在 2.5~5.5 之间 LacA 催化氧化愈创木酚的 Km 和 Vmax 分别为 286.5 µmol⋅L−1 和 292.4nmol⋅ mL−1 ⋅ min−1 催化氧化愈创木酚的 Km 和 Vmax 分别为 813.0 µmol ⋅ L−1 和 127.4nmol ⋅ mL−1 ⋅ min−1
证实洗脱液 1 和洗脱液 2 所含蛋白质均为电泳均一变纯(图 3) 结合图 1 结果 可判定洗脱液 1 所含酶蛋白即为 LacA 洗脱液 2 即为 LacB 3.2.3 纯化结果
对以上各步样品的酶活力和蛋白质含量的测定结果见
图 3 PAGE-电泳蛋白质谱带 Fig.3 PAGE of laccases by C.versicolor stained with
2.3.12 漆酶的动力学参数测定
用 5mmol⋅L−1 pH 4.5 琥珀酸缓冲液分别配制不同浓度的愈创木酚底物 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 反应 30min
大反应速率
V
[ max
18]
3 结果与分析
测定反应速率
采用 Lineweaver-Burk 双倒数法求得米氏常数 Km 和最
mol⋅L−1 HCl 按碱-酸-碱依次冲洗 每次用蒸馏水冲洗至中性 然后装柱 用 pH 7.1 0.02mol⋅L−1 Tris-HCl
缓冲液静置平衡过夜 将上步超滤浓缩后的样品 4mL 加到已平衡的 DEAE-Sephadex A-250 柱上(2.8 cm
30cm), 以同一缓冲液充分洗柱 然后以含 0.02 mol⋅L−1NaCl 的 200mL 同一缓冲液冲洗柱上杂蛋白,
2.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
按 Laemmli 方法进行[14,15] 不连续缓冲体系凝胶浓度为 12% 电极缓冲液 pH 值为 8.3 电泳后
凝胶板用美国 UVP 公司凝胶成像分析系统 GDS-7500 进行分析
2.3.6 等电聚焦
按 Vesterberg 薄层凝胶等电聚焦法进行[14,17] 凝胶薄层大小为 100mm 200mm 1mm 凝胶浓度
Coomassie brilliant blue G-250. Lane ss: the cultur filtrate of C.versicolor; Lane 1: the fraction collected from tube 6 to tube12; Lane 2: the fraction collected from tube 26 to tube 34
2.3.7 漆酶谱带检测
PAGE-凝胶电泳完毕后 取下凝胶 用刀片沿泳道切取两部分 一部分用 Coomassie brilliant blue
G-250 蛋白染色剂染色 检测蛋白质谱带 另一部分先用蒸馏水冲洗 然后放入含有 0.4mmol⋅L−1 愈
创木酚的 50mmol⋅L−1 琥珀酸缓冲液(pH 4.0)中 30 反应 30min 反应结束后将两部分进行对照比较
0
0
0
10
20
30
40
Fraction number
图 2 漆酶的 DEAE-Sephadex A-250 柱层析图 Fig.2 Chromatography of laccase on DEAE-Sephadex A-250
3.2 漆酶的分步提纯 3.2.1 粗酶液的制备和超滤浓缩
用快速定性滤纸过滤最优发酵条件下的杂色云芝发酵
实验室, 湖北 武汉 430070)
摘 要 杂色云芝发酵液 经超滤 DEAE- Sephadex A250 柱层析两步分离 纯化出两型漆酶 以愈创木酚与酶带
在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带 两型漆酶分别命名为 LacA 和 LacB 经测定两漆酶亚基的分子量 分别为 66.0 kDa 和 30.7kDa 等电点 pI 分别为 4.79 和 5.18 LacA 的最适作用温度是 40 LacB 为 50 保温 2h, LacA 的半失活温度为 60 LacB 为 90 LacA 和 LacB 催化愈创木酚的酶活最适 pH 值均为 4.0 二者的稳定 pH 值
万方数据
174
高校化学工程学报
2003 年 4
月
2.3 研究方法
2.3.1 粗酶液制备和超滤浓缩
以杂色云芝最优发酵条件所产发酵液滤液为漆酶粗酶液[12] 超滤浓缩见本文 3.2.1 节
2.3.2 酶活力的测定及活力单位定义
漆酶活力测定 10mL 反应液中含 5mmol⋅L−1 琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)1mL 4mmol⋅L−1 愈创木酚 1mL
2 材料与方法
2.1 菌种 杂色云芝(Coriolus versicolor) 由上海农科院食用菌所惠赠[12]
2.2 主要试剂与仪器 DEAE-Sephadex A-250(Pharmacia 产品) 电泳用 Arc Bis(BBI 公司进口分装产品) 低分子量标
准蛋白(LMW Kit Proteins, 上海生物化学研究所 ) Vivascience VFP001 超滤装置( Vivascience Ltd), UV-755 型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂) DYY-III-5 电泳仪(北京市六一仪 器厂) 等电聚焦电泳仪(PHARMACIA LKB Multiphor II, Pharmacia) 所用试剂均为分析纯
A 280nm Lac act / u·mL-1
LacA LacB
1
25
+ A280nm
0.8
• NaCl(mol⋅L−1 )
20
0.6
Ο Lac act(u⋅mL−1) 15
0.4
10
0.2
5
图 1 漆酶酶谱检测图 Fig.1 PAGE of the culture filtrate of C.versicolor. Lane 1: proteins stained with Coomassie brilliant blue G-250; Lane 2: zymogram of laccse stained with guiaiacol
Purification step Volume / mL
Protein / mg
Activity / unit
Filtrate
980
1492.05
Superfiltrate
90
280.58
DEAE-Sephadex
A-250 column
LacA
320
29.20
LacB
160
8.74
3.3 漆酶分子量和等电点的测定
液[15,16] 获得 980mL 粗酶液 再用 10kDa 分子量滤膜的 minipore 超滤器超滤 经超滤浓缩得 90mL 浓缩液
3.2.2 DEAE-Sephadex A-250 柱层析 将浓缩液层析 依次洗脱出 2 个具有漆酶活性的峰(图
2) 合并 6~12 管和 26~34 管 分别得到 24mL 的洗脱液 1 和 32mL 的洗脱液 2 再将洗脱液进行 PAGE 检测 结果
第 17 卷第 2 期 2003 年 4 月
高校化学工程学报 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities
文章编号： 1003-9015(2003)02-0173-07
杂色云芝漆酶的分离 纯化和酶学特性研究
No.2 Vol.17 Apr. 2003
收稿日期 2001-09-15 修订日期 2002-03-15 基金项目 华中农业大学农业部微生物重点开放实验室项目(AML2000 005) 国家自然科学基金资助项目(30170030) 作者简介 吴坤(1963-) 男 河南平舆人 河南农业大学副教授 浙江大学博士生 通讯联系人 闵航; E-mail: minhang@
吴 坤 1,2, 闵 航 1, 朱显峰 3, 贾新成 2, 张世敏 2, 喻子牛 4 (1. 浙江大学生命科学学院, 浙江 杭州 310029; 2. 河南农业大学生物工程学院, 河南 郑州 450002 3. 河南大学生物工程系, 河南 开封 475001; 4. 华中农业大学农业部微生物重点开放
关键词 漆酶 杂色云芝 酶的纯化 酶学特性
LacB
中图分类号 Q554.9
文献标识码 A
1前 言
漆酶为含铜多酚氧化酶 可分漆树漆酶和真菌漆酶两类 分别主要来源于生漆和真菌 作为一种 多酚氧化酶 漆酶可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物 氧化时 酚或芳胺先失去一个电子生成自由 基 后者再发生一系列非酶学的裂解或聚合反应 对于木质素模型化合物 漆酶可催化其聚合生成复 杂的产物 也可催化芳香环支链 - 键断裂[1,2,3] 由于漆酶在降解木质素方面有显著效果 近年来使 得漆酶及其产生菌 白腐菌越来越多地被用于降解与木质素结构单元相类似的对自然界造成严重污 染的一些环境污染物[4,5] 如 DDT 林丹 氯丹 二氯苯胺 多氯联苯 二噁英 二茂铁 [6,7,8] 茚并 芘 菲 蒽 芴芘 蒽油 杂酚油 煤焦油等[9,10] 因而成为生物学 化学和环境科学等领域十分活 跃的一个研究热点[9,11] 国内对于漆酶的研究主要集中于漆树漆酶 而有关真菌漆酶的研究报告甚为 少见 本文将对杂色云芝漆酶的分离 纯化和酶学特性进行研究