六α淀粉酶酶学性质测定II改
二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)
根据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力
5.1.3 计算酶活力
X=c×n
其中：X—样品的酶活力，单位为u/g c—测试酶液的酶活力，单位为u/g n—样品的稀释倍数
5.3 注意事项
✓ 酶反应时间应准确计算。 ✓ 试剂加入按规定顺序进行。
6.实验报告
✓ 记时器
每组 1台
3.2 器材（每组）
✓ 15ml大试管10支 ✓ 5ml移液管10支 ✓ 1ml移液管5支 ✓ 10ml移液管10支 ✓ 比色皿1套（4个） ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 洗瓶1个 ✓ 玻璃平皿1套 ✓ 50ml小广口瓶（棕色）2个 ✓ 50ml 容量瓶 1个 ✓ 100ml 容量瓶 1个 ✓ 500ml 试剂瓶2个 ✓ 100ml 试剂瓶2个 ✓ 250ml 三角瓶2个 ✓ 200ml烧杯2个 ✓ 500ml烧杯1个 ✓ 记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、
生物技术专业系统实验（四）
——酶（蛋白质）工程实验II
二、α-淀粉酶活力的测定
--国家标准GB 8275-2009
1.目的意义 2.实验原理 3.试剂和溶液 4.仪器和器材 5.实验方法 6.实验报告 7.思考题
1.目的意义
➢ 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖 苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的 主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。
➢ 例如，生产葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但 仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶 液，葡萄糖的生成速度非常慢。此时，α淀粉酶的使用就成为必要条件。
➢ α-淀粉酶的活性测定，在理论 研究和实际应用中具有重要的 意义。
➢ 通过本实验，学习一种测定α淀粉酶酶活力的方法，巩固并 熟练分光光度计的使用方法。
α-淀粉酶酶活测定
中温α–淀粉酶酶活测定一、原理α–淀粉酶制剂能将淀粉链中的α-1，4-葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特性反应应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。
二、试剂和溶液1. 碘2. 碘化钾3. 原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。
4. 稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加20.0g碘化钾并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。
5. 可溶性淀粉溶液（20g/L）:称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。
溶液现配现用。
6. 磷酸缓冲液（pH=6.0）：称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和8.07g柠檬酸（C6H8O7·H2O）,用水溶解并定容至1000mL。
用pH计校正后用。
7. 盐酸溶液[c（HCL）=0.1mol/L]：按GB/T601配制。
三、仪器1. 分光光度计。
2. 恒温水浴：控温精度±0.1℃。
3. 自动移液器。
4. 试管：25mm×200mm。
5. 秒表。
四、分析步骤1. 待测酶液的制备称取1g~2g酶粉（精确至0.0001g）或准备吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液（2.6）充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液（2.6）充分研磨，最终样品全部移入定量瓶中，用磷酸缓冲液（2.6）定容至刻度，摇匀。
用四层纱布过滤，滤液待用。
注：待测中温α–淀粉酶酶液活力控制酶浓度在3.4u/Ml~4.5u/mL范围内，待耐高温α-淀粉活力控制酶浓度在60u/Ml~65u/mL范围内。
2. 测定---吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.00mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃（耐高温α-淀粉酶制剂于70℃±0.2℃）恒温水浴中预热8min；---加入1.00mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；---立即用自动移液吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速定其吸光度（A）.五、计算1. 根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。
五、α-淀粉酶酶学性质测定I2010(精)
4.1 最适pH值的测定—α-淀粉酶
• 以下表内容测定最适pH值 pH值 指标
OD660 （测三次 平均值） 酶活 （U/g）
3.0 4.0 5.0 6.0 7.2 8.0
4.2 最适反应温度的测定—α-淀粉酶
• 以下表内容测定最适温度
温度 5 ℃ 指标
20 （冰 ℃( 箱） 室温) 30 ℃ 40 ℃ 50 ℃ 60 ℃ 70 ℃ 80 ℃
3.2 器材（每组）
15ml 大试管20支 5ml 移液管10支 1ml 移液管10支 10ml 移液管10支 200ml 烧杯2个 100ml 烧杯2个 玻棒 2支 双蒸水1瓶（50ml） 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 吸耳球 2个 记号笔2支 陶瓷盘1个 试管架2个
另外，酶对温度的稳定性与其存在形式有关。 有些酶的干燥制剂，虽加热到1000C，其活性并无 明显变化。但在1000C的溶液中却很快地完全失去 活性。 参考：α-淀粉酶最适温度55-700C；最适 pH4.5－7.0。
3.仪器试剂
3.1 试剂 3.1.1 1%α-淀粉酶液（双蒸水配制500ml，教师准备） 3.1.2 3.1.3 稀碘液
生物技术专业系统实验（四）
—酶（蛋白质）工程实验V
五、α-淀粉酶酶学性质测定I（最适pH值及最适度的测定)• 1.目的意义
• 3.仪器设备 • 5.实验报告
2.实验原理
4.实验方法 6.思考题
1.目的意义
• 影响酶促反应的因素有：底物浓度（S），pH，T，激活剂，抑制剂等。 酶促反应是在非常温和的条件下（常温、常压、中性pH）高效专一地 完成催化反应的过程。酶对温度和酸碱条件极其敏感，这些条件的变 化可导致酶活性下降甚至丧失。 • 通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细 菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶 的最适pH为3。碱性α-淀粉酶的最适pH在9到12之间。另外，温度和 钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH会有一定的影响，能够改变其最适 作用范围pH。 • 不同微生物来源的α-淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中 最适作用温度低的只有25℃-30℃，而最高的能达到100℃-130℃。
六α淀粉酶酶学性质测定II改
（米氏常数Km值的测定)
1.目的意义
由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提 出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学 中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个 酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。
4.1 测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
底物浓度[S]（mg·mL-1）
4
6
8
10
12
14
16
18
20
10mg/ml淀粉溶液（ml） 0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
醋酸缓冲液（ml）
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
预热
V V max[S] Km [S]
1 Km 1 1
V V max
[S]
V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线 在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
3.1 试剂
➢ 10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml ➢ 0.005% 碘液 2000ml ➢ 0.25M 醋酸溶液 ➢ 0.4M pH6.0醋酸缓冲液
米氏方程形式如下所示：
V V max[S] Km [S]
• 其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称 为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一
α淀粉酶测定方法
α淀粉酶测定方法嘿，咱今儿就来聊聊α淀粉酶测定方法这档子事儿。
你知道吗，α淀粉酶就像是个勤劳的小工匠，在我们身体里默默工作着，对很多生理过程都有着重要作用呢！那要怎么知道它工作得好不好呀，这就得靠测定方法啦。
比如说有一种比色法，就好像是给α淀粉酶来一场特殊的“考试”。
把样本放进去，然后通过一系列的反应和观察颜色的变化，就能大致了解它的情况啦。
这就好比你看一个人做事，通过他完成任务后的成果来判断他干得怎么样。
还有一种黏度法呢，就像是感受α淀粉酶工作时带来的“阻力”变化。
通过测量样本的黏度变化，就能推测出α淀粉酶的活跃程度啦。
这有点像观察水流的顺畅程度来判断有没有东西在里面捣乱一样。
酶联免疫吸附法也挺有意思，它就像是专门去捕捉α淀粉酶的“小侦探”。
通过特定的抗体和反应，精准地找到α淀粉酶并进行检测。
这就好像警察抓小偷，有着专门的手段和工具呢。
你想想看呀，如果没有这些测定方法，我们怎么能知道身体里这个小家伙工作得好不好呢？这可关系到我们的健康呀！要是它出了啥问题，咱不就麻烦啦？所以这些测定方法就像是我们了解身体内部情况的小窗口，透过它们，我们能更好地掌握身体的状态呢。
那这些方法难不难呢？其实呀，只要认真去学，也没那么难啦。
就跟你学骑自行车似的，一开始可能觉得摇摇晃晃不好掌握，但多练习几次，不就会啦？而且这些方法都是科学家们经过研究和实践才找到的呢，肯定是有道理的呀。
咱可不能小瞧了这些测定方法哦，它们可是帮了大忙呢！能让医生及时发现问题，及时治疗。
你说这多重要呀！所以呀，了解α淀粉酶测定方法真的很有必要呢，你说是不是呢？咱得重视起来呀，毕竟这关系到我们自己的身体呢！不管是比色法、黏度法还是酶联免疫吸附法，它们都有着独特的作用和价值，就像我们生活中的各种工具一样，各有各的用处。
那我们就得好好利用这些方法，让它们为我们的健康服务呀！。
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
高中生物第二部分酶的应用实验6α_淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测自我小测浙科版选修精编版
高中生物第二部分酶的应用实验6α_淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测自我小测浙科版选修精编版第二部分酶的应用实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测1淀粉在有关酶的作用下依次生成的物质是…()①糊精②葡萄糖③果胶④麦芽糖⑤蔗糖A．①②③④⑤ B．⑤④①②③C．①③⑤② D．①④②2本实验中α-淀粉酶的固定是将其水溶性的酶用物理或化学的方法固定在下列的哪一物质上( )A．有机硅胶 B．活性炭C．石英砂 D．明胶3下列叙述中不属于本实验所使用的α-淀粉酶特性的是( )A．是大肠杆菌的α-淀粉酶B．其作用的最适pH是5.5～7.5C．其作用的最适温度是50～75 ℃D．其化学本质是蛋白质4将固定化酶装柱后，当底物经过该柱时，底物发生的变化是( ) A．底物被稀释了B．底物被浓缩了C．底物的结构变得更加稳定了D．底物被酶水解成产物了5本实验保存在冰箱中取出后再重复实验，将得到下列的哪一结果( )A．由于时间太久，酶已经失去了活性，因此，用淀粉指示剂鉴定后溶液不显色B．由于时间太久，酶已经失去了活性，因此，用淀粉指示剂鉴定后溶液显蓝色C．固定化酶是能够较长时间保持活性的，因此，用淀粉指示剂鉴定后溶液显红色D．固定化酶是能够较长时间保持活性的，因此，用淀粉指示剂鉴定后溶液显无色6(2009江苏高考，3)下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物7在淀粉水解成葡萄糖的过程中，依次起作用的酶是( )①糖化淀粉酶②β-淀粉酶③α-淀粉酶A．①②③ B．③②①C ．①③② D．③①②8下列关于对固定化酶中用到的反应柱的理解，正确的是( )A ．反应物和酶均可自由通过反应柱B ．反应物和酶均不能通过反应柱C ．反应物能通过，酶不能通过D ．反应物不能通过，酶能通过9关于固定化酶技术说法正确的是( )A ．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B ．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应C ．固定化酶中的酶无法重复利用D ．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术10多孔玻璃可使木瓜蛋白酶固定，这一固定化酶的方法属于下列的( )A ．共价偶联法B ．吸附法C ．交联法D ．包埋法11参照教材实验，请简述用多孔玻璃固定木瓜蛋白酶的方法。
淀粉酶、α酶、β酶活力的测定
三、材料、仪器与试剂
(2) 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液A液：(0.1MOL/L柠檬酸)： 称取C6H8O7·H2O 21.01克，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液： (0.1MOL/L柠檬酸钠)：称取NA3C6H5O7 · 2H2O 29.41克，用蒸馏水 溶解并定容至1L。取A液55毫升与B液145毫升混匀，即为0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液。 (3)1%淀粉溶液：称取1克淀粉溶于100ML 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬 酸缓冲液中。
Α-淀粉酶活力的测定
一、实验目的 二、实验原理 三、材料、仪器与 试剂 四、操作步骤 五、结果处理 六、思考题
一、实验目的：
• 学习和掌握测定α-淀粉酶活力的原理和方法
二、实验原理：
总淀粉酶活力测定过程中提取的淀粉酶原液主要包括Α-淀粉酶和Β-淀粉酶两种。 两种淀粉酶特性不同，A-淀粉酶不耐酸，在 PH=3.6的环境下以下迅速钝化。 Β 淀粉酶不耐热，在70°C环境下15分钟后就会钝化。根据它们的这种特性，在测定 活力时钝化其中之一，就可测出另-种淀粉酶的活力。 • 实验二采用加热的方法钝化Β -淀粉酶，测出A-淀粉酶的活力。 • 实验三采用加酸的方法钝化A-淀粉酶，测出Β -淀粉酶的活力。
四、操作步骤：
1.淀粉酶液的制备： 称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英 砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定 容到100mL。在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟摇动1次，使 其充分提取。取适量在3000r/min转速下离心10min，上清液即为淀粉 酶原液，稀释后用于淀粉酶总活力测定(稀释倍数依具体情况而定)。
(2)还原糖测定： 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温。用蒸馏水定容至20mL， 加塞后颠倒混匀。在分光光度计上(波长540nm)进行比色。
α-淀粉酶活力的测定-实验指导书
实验一α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。
二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。
三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。
3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70m L沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100m L。
此溶液需要当天配制。
注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。
4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。
配好后用pH计校正。
（二）仪器1. 分光光度计应符合GB9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。
实验二：淀粉酶活性测定实验报告
淀粉酶活性的测定一、实验目的酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。
酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。
α-淀粉酶是一种典型的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。
作为一种最重要的工业酶制剂，α-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。
其中，微生物α-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。
目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种。
本实验采用杨氏改良法测定α-淀粉酶；掌握测定α-淀粉酶活性大小与温度关系的方法，通过分析得出酶的最适温度范围。
二、实验原理酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用时的最适温度和pH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低，其变化趋势呈钟形曲线变化。
不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。
α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。
用分管光度计检测显色效应大小，通过分管光度值计算酶活力注意：实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。
在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。
并且在酶的作用过程中，三支测定管及空白管不要混淆。
三、材料、试剂与仪器实验材料：α-淀粉酶仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干试剂：① 0.4M NaOH/0.4M CHCOOH及0.1M HCl：3和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL；② 0.005%工作碘液：0.5克I2③1%糊化淀粉溶液：称取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，60℃5min，冷却后加25mL0.4MCOOH，定容至100mL；CH3④稀释α-淀粉酶溶液：待测样品四、实验步骤① 10mL1%淀粉溶液加入试管中，室温25/45/65℃保温10min②于每管中各加酶稀释液1mL，在室温25/45/65℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热10min，冷却。
淀粉酶活的测定
α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。
二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。
三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。
3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。
此溶液需要当天配制。
注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。
4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。
配好后用pH计校正。
（二）仪器1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。
通过4层纱布过滤，滤液供测定用。
2. 测定（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。
淀粉酶活性测定实验报告(完整版)
报告编号：YT-FS-2637-32淀粉酶活性测定实验报告(完整版)After Completing The T ask According To The Original Plan, A Report Will Be Formed T o Reflect The Basic Situation Encountered, Reveal The Existing Problems And Put Forward Future Ideas.互惠互利共同繁荣Mutual Benefit And Common Prosperity淀粉酶活性测定实验报告(完整版)备注：该报告书文本主要按照原定计划完成任务后形成报告，并反映遇到的基本情况、实际取得的成功和过程中取得的经验教训、揭露存在的问题以及提出今后设想。
文档可根据实际情况进行修改和使用。
淀粉酶活性的测定一、研究背景及目的酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。
酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。
酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。
α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。
β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。
α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。
目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。
这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延二、实验原理萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。
α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)
pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
0.2mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： 称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O） 45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先 在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定 容至1000ml。
2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制
2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入 小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后 在搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续 煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。 标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少 量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的 蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数 滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。
酶活力测定的定义 （碘比色法——目视）
酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊 精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。 计算公式：
60 48 N 酶活力单位 20 2% N 0.5 ( / mL) t t
ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成
标准终点色溶液
1、第一种标准终点色溶液 取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。 2、第二种标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O） 40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g， 用蒸馏水定容至500ml。 B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容 至100ml。 同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱 中待用。混合液在15天内使用有效。
相关碘液的配制
碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧 杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容 量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次， 洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。 摇均后放于棕色瓶中备用。 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g， 再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色 瓶中备用（时间不易太长？）。 标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾 8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色 瓶内。
高中生物 第2部分 酶的应用 实验6 α 淀粉酶的固定化
实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、酶与固定化酶1．酶 活细胞产生的具有催化作用的一类有机物，它是生物体内各种化学反应的催化剂。
2．固定化酶将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
3．将酶改造成固定化酶的原因由于酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用，所以要将酶改造成固定化酶。
4．酶固定化的方法吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。
本实验用的是吸附法。
5．固定化酶作用的机理将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。
在酶固定化的各种方法中，哪一种方法对酶的作用影响较小？【提示】 吸附法二、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验1．实验目的(1)制备固定化α-淀粉酶。
(2)进行淀粉水解作用的检测。
2．实验原理将α-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。
用淀粉指示剂测试，若流出物呈红色，表明糊精生成。
3．本实验使用的酶及特性本实验使用的酶是枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适pH 为5.5～7.5，最适温度为50～75_℃。
4．实验材料及其制备(1)α-淀粉酶的固定化：在烧杯中将5 mg α-淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中(由于酶不纯，可能有些不溶物)↓再加入5 g石英砂，不时搅拌30 min↓30 min后将上述溶液装入1支注射器中(该注射器的下端接有气门心，并用夹子封住)↓用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1 mL/min(2)可溶性淀粉溶液：取50 mg可溶性淀粉溶于100 mL热水中，搅拌均匀。
(3)KI-I2溶液：称取0.127 g碘和0.83 g碘化钾。
加蒸馏水100 mL，完全溶解后装入滴瓶中。
5．实验步骤(1)淀粉溶液流经固定化酶柱将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使该溶液以0.3 mL/min的流速过柱。
(2)接取流出物待从固定化酶柱中流出5 mL淀粉溶液后，接收0.5 mL流出液。
实验六：a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测(18张PPT)
根据吸附剂的特点分为两种：
物理吸附法
通过氢键、疏水键等作用 力将酶吸附于固体吸附剂 的方法.如有机硅胶、活性 炭和石英砂等 利用酶的两性基团和离子 交换剂的相互作用（离子 键）。吸附量大
离子结合法
包埋法
将酶包埋在多孔的载体中，包 埋成格子型或包埋成微胶囊型。
实验六：α-淀粉酶的固定 化及淀粉水解作用的检测
酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性。 现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。 然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些 实际问题： （1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和 有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回 收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。
实验结果：
淀粉
5ml注射
• 淀粉溶液+指示剂： 呈蓝色 • 亲和层析洗脱液+指示剂： 呈红色 • 贮于冰箱几天后重复实 验： 呈红色
器 反应 柱 固定化酶
气门心 夹 子
讨论
1、试验中为什么要待固定化酶柱中流 出5ml液体后再接收流出液用于鉴定？
答案：因为固定化酶柱中的酶与流 经柱子的淀粉反应需要一定的时间， 刚开始流出的液体中由于反应时间 过短，糊精未生成或生成的量太少， 所以不利于后面的颜色鉴定。
固定化酶的优点
• （1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化反 应的过程可管道化、连续化和自动化； • （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易 纯化； • （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工 厂化生产； • （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间 贮存和使用； 固定化酶的不足之处 不能催化一系列反应
浙科版高中生物选修1 第二部分 实验6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测_教案设计1
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测【教学目标】（一）知识目标1．学生通过实验等教学活动，掌握酶的固定化技术、以及通过对实验结果的分析检测，能得出酶是否被固定，固定后的酶对底物是否产生了作用；2．学生通过实验探究，设置对照，对此项生物学的研究方法有了更深的认识；（二）能力目标1．学生通过实验过程的体验，提高实验设计能力，学会描述实验研究的基本过程；2．学生通过实验的探究和操作过程来提高实验动手操作能力；3．学生通过对本节课研究的原理在生物学里领域以及生活领域的实例分析，提高了学生的只是知识应用与分析能力。
（三）情感目标1．学生通过实验探究活动中的分工协作，形成合作的团队意识；2．引导学生思考实验部分内容，提高学生的思维能力，引导学生确认固定后的α-淀粉酶能是淀粉变为糊精；3．通过实验培养学生的思考能力，以及学生能够养成做事认真、细心的习惯。
【教学重点】1．掌握α淀粉酶的固定化技术；2．利用固定后的α淀粉酶进行淀粉的水解实验，并验证固定化酶是否有效。
【教学难点】1．淀粉酶固定化的过程中，学生需要掌握和理解这种固定化方式。
2．学生需要理解实验中相关步骤的中注意事项，由于实验教学课课时较少，本次实验操作过程比较繁杂，因此要掌握好讲授实验和实验期间辅导的内容。
【教学流程】1．题目和已有知识引入，牵入本次实验的主要思路；2．教学环节1：介绍α-淀粉酶的固定方法，以及注意事项；3．教学环节2：介绍为何使用层析柱，以及部分操作注意事项，期间提出问题引发学生思考；4．教学环节3：检测酶对淀粉的水解作用，依据实验原理，让学生自主探究如何检验淀粉是否水解；5．教学环节5：学生开始实验；6．总结。
【教学过程】教学程序教师行为学生活动设计意图引入（5min）进入课题“α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测”。
已了解的：酶、淀粉、水解作用未接触过的：固定化通过现实中对固定的理解引到实验中的“固定化”；阅读课本上的原理和资料，学生理解：固定化酶、固定化酶的方法、吸附法、吸附剂（期间请同学起来分享自己了解到的相关信息、在对固定化酶的理解上借助磁铁和大头针的关系辅助理解）引出石英砂，简要解释石英砂的优势；游离酶与固定化酶的比较（为何用固定化酶）：此处通过讨论游离酶的不足引出固定化酶的优势。
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解2
实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测高二年级班姓名实验日期：____月日【知识准备】1．背景知识酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶作用下转变为产物。
2．实验原理本实验是采用吸附法制备固定化酶。
（1）使用的吸附剂是石英砂，石英砂是由天然矿石粉碎而成，它的化学成分是二氧化硅，其化学反应活性很低。
（2）使用的α-淀粉酶通常由枯草杆菌深层发酵制备，具有较强的液化淀粉的能力，可用于制备糊精，其最适pH5.5～7.5，最适温度50℃～75℃。
3．各种淀粉酶水解淀粉的反应如下：α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精，淀粉溶液加入KI-I2指示溶液时显现蓝色，而转变成糊精后显现红色。
将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱，使淀粉溶液流过柱，若柱的流出液在加入KI-I2溶液时可看到溶液呈现红色，表明水解产物中有糊精。
α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后，酶的稳定性增加，包括酶对热的稳定性，对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。
由于稳定性增加，保存期也相应延长，数日内酶活力不减。
4．思考题①为什么使用石英砂作为酶的吸附剂？②如何证明α-淀粉酶已将淀粉水解？③如何证明洗涤固定化酶的流出液中没有淀粉酶？【实验目的】1．制备固定化的α-淀粉酶2．固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定【材料用具】α-淀粉酶溶液，0.5%淀粉溶液，石英砂，5mmol/L KI-I2溶液，蒸馏水5ml层析柱50mL烧杯，250mL烧杯，滴管，玻璃棒，点样板铁架台【实验步骤】一、新制淀粉固定化酶1．用50ml小烧杯称取5g石英砂，加入2ml α–淀粉酶溶液，浸泡10分钟，使α–淀粉酶固定到石英砂上。
在等候期间可以先完成实验步骤“二”。
2．用10～15ml的蒸馏水清洗石英砂后，取清洗液2滴加到点样板上，同时滴加0.5%淀粉溶液混匀，再加入1滴KI-I2溶液，若溶液变为蓝色，说明未固定到石英砂上的α–淀粉酶已完全除去。
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4.2 数据处理
• 各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦 干）。
• 由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。
• 由于测定所用单位为mg·mL-1换算为Km单位g·L-1 。 • 由1/V对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化可
40℃ 5min
α-淀粉酶 （ml）
1
反管加入0.25M醋酸10ml 取1ml反应液加入预先加入试管中的0.005%碘液中，振荡混匀
A(OD700nm) 1/A
1/[S]( mg·ml-1)
注意：每组（不同底物浓度） 都需要设置D0为对照，计算出 U值。
chenhuicheng@
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,
即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。
• 因此,米氏常数的单位为mol/L(在本实验中单位为g/L)。
• 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理 常数。
六、α-淀粉酶酶学性质测定II
（米氏常数Km值的测定)
1.目的意义
由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提 出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学 中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个 酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。
4.1 测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
底物浓度[S]（mg·mL-1）
4
6
8
10
12
14
16
18
20
10mg/ml淀粉溶液（ml） 0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
醋酸缓冲液（ml）
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
预热
V V max[S] Km [S]
1 Km 1 1
V V max
[S]
V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线 在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
3.1 试剂
➢ 10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml ➢ 0.005% 碘液 2000ml ➢ 0.25M 醋酸溶液 ➢ 0.4M pH6.0醋酸缓冲液
2.实验原理
➢ 底物浓度对酶促反应的影响
• 在酶浓度、pH、温度等条件不变 的情况下研究底物浓度和反应速 度的关系。如右图所示：
• 在低底物浓度时, 反应速度与底物 浓度成正比，表现为一级反应特 征。
• 当底物浓度达到一定值，几乎所 有的酶都与底物结合后，反应速
度达到最大值（Vmax），此时再
增加底物浓度，反应速度不再增 加，表现为零级反应。
溶性淀粉溶解的米氏常数Km（当y=0时，求x值）。 • 作图以1-5管数据来做。
U
V
1/V
(U/30min)
[S] 1/[S]
移液器各1支； ✓ 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） ✓ 旋涡混合器1套（置于每组桌上）
4.实验方法
• 取一定量的酶（稀释为10-6倍）； • 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； • 在一定时间内测定产物的量（30min）； • 建立x，y轴，作图，建立回归方程； • 在Y=0时，求其x值（即[S]）→Km；
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测
定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测 试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km 和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中 确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近 Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们 都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即 Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程 (double-reciprocal plot)：
• Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定 的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
• Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和 程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的 催化活性高。
• 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者 为酶最佳底物，即天然底物。
3.2 器材
✓ 15ml 大试管20支 ✓ 1ml 移液管2支 ✓ 5ml 移液管2支 ✓ 10ml 移液管2支 ✓ 200ml 烧杯2个 ✓ 100ml 烧杯2个 ✓ 玻棒 1支 ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 ✓ 吸耳球 1个 ✓ 记号笔1支 ✓ 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl
米氏方程形式如下所示：
V V max[S] Km [S]
• 其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称 为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一
半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度 [S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图 为米氏方程的模拟作图：