六α淀粉酶酶学性质测定II改
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
溶性淀粉溶解的米氏常数Km（当y=0时，求x值）。 • 作图以1-5管数据来做。
U
V
1/V
(U/30min)
[S] 1/[S]
40℃ 5min
α-淀粉酶 （ml）
1
反应时间
30min
反应终止 显色反应
各管加入0.25M醋酸10ml 取1ml反应液加入预先加入试管中的0.005%碘液中，振荡混匀
A(OD700nm) 1/A
1/[S]( mg·ml-1)
注意：每组（不同底物浓度） 都需要设置D0为对照，计算出 U值。
chenhuicheng@ynu.edu.cn
移液器各1支； ✓ 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） ✓ 旋涡混合器1套（置于每组桌上）
4.实验方法
• 取一定量的酶（稀释为10-6倍）； • 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； • 在一定时间内测定产物的量（30min）； • 建立x，y轴，作图，建立回归方程； • 在Y=0时，求其x值（即[S]）→Km；
ຫໍສະໝຸດ Baidu
4.2 数据处理
• 各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦 干）。
• 由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。
• 由于测定所用单位为mg·mL-1换算为Km单位g·L-1 。 • 由1/V对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化可
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测
定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测 试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km 和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中 确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近 Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们 都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即 Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程 (double-reciprocal plot)：
• Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定 的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
• Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和 程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的 催化活性高。
• 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者 为酶最佳底物，即天然底物。
4.1 测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
底物浓度[S]（mg·mL-1）
4
6
8
10
12
14
16
18
20
10mg/ml淀粉溶液（ml） 0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
醋酸缓冲液（ml）
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
预热
2.实验原理
➢ 底物浓度对酶促反应的影响
• 在酶浓度、pH、温度等条件不变 的情况下研究底物浓度和反应速 度的关系。如右图所示：
• 在低底物浓度时, 反应速度与底物 浓度成正比，表现为一级反应特 征。
• 当底物浓度达到一定值，几乎所 有的酶都与底物结合后，反应速
度达到最大值（Vmax），此时再
增加底物浓度，反应速度不再增 加，表现为零级反应。
米氏方程形式如下所示：
V V max[S] Km [S]
• 其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称 为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一
半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度 [S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图 为米氏方程的模拟作图：
3.2 器材
✓ 15ml 大试管20支 ✓ 1ml 移液管2支 ✓ 5ml 移液管2支 ✓ 10ml 移液管2支 ✓ 200ml 烧杯2个 ✓ 100ml 烧杯2个 ✓ 玻棒 1支 ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 ✓ 吸耳球 1个 ✓ 记号笔1支 ✓ 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl
六、α-淀粉酶酶学性质测定II
（米氏常数Km值的测定)
1.目的意义
由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提 出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学 中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个 酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。
V V max[S] Km [S]
1 Km 1 1
V V max
[S]
V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线 在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
3.1 试剂
➢ 10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml ➢ 0.005% 碘液 2000ml ➢ 0.25M 醋酸溶液 ➢ 0.4M pH6.0醋酸缓冲液
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,
即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。
• 因此,米氏常数的单位为mol/L(在本实验中单位为g/L)。
• 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理 常数。
U
V
1/V
(U/30min)
[S] 1/[S]
40℃ 5min
α-淀粉酶 （ml）
1
反应时间
30min
反应终止 显色反应
各管加入0.25M醋酸10ml 取1ml反应液加入预先加入试管中的0.005%碘液中，振荡混匀
A(OD700nm) 1/A
1/[S]( mg·ml-1)
注意：每组（不同底物浓度） 都需要设置D0为对照，计算出 U值。
chenhuicheng@ynu.edu.cn
移液器各1支； ✓ 小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌） ✓ 旋涡混合器1套（置于每组桌上）
4.实验方法
• 取一定量的酶（稀释为10-6倍）； • 加入各种不同浓度的底物（如表所示）； • 在一定时间内测定产物的量（30min）； • 建立x，y轴，作图，建立回归方程； • 在Y=0时，求其x值（即[S]）→Km；
ຫໍສະໝຸດ Baidu
4.2 数据处理
• 各管在700nm测定OD700nm值（注意，比色皿务必洗净擦 干）。
• 由于光密度（OD700nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为30min。计算1/V，以1/V为纵坐标作图。
• 由于测定所用单位为mg·mL-1换算为Km单位g·L-1 。 • 由1/V对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化可
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测
定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测 试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km 和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中 确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近 Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们 都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即 Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程 (double-reciprocal plot)：
• Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定 的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
• Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和 程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的 催化活性高。
• 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者 为酶最佳底物，即天然底物。
4.1 测定—取12支试管，分别标记，按照下表操作。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
底物浓度[S]（mg·mL-1）
4
6
8
10
12
14
16
18
20
10mg/ml淀粉溶液（ml） 0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
醋酸缓冲液（ml）
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
预热
2.实验原理
➢ 底物浓度对酶促反应的影响
• 在酶浓度、pH、温度等条件不变 的情况下研究底物浓度和反应速 度的关系。如右图所示：
• 在低底物浓度时, 反应速度与底物 浓度成正比，表现为一级反应特 征。
• 当底物浓度达到一定值，几乎所 有的酶都与底物结合后，反应速
度达到最大值（Vmax），此时再
增加底物浓度，反应速度不再增 加，表现为零级反应。
米氏方程形式如下所示：
V V max[S] Km [S]
• 其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称 为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一
半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度 [S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图 为米氏方程的模拟作图：
3.2 器材
✓ 15ml 大试管20支 ✓ 1ml 移液管2支 ✓ 5ml 移液管2支 ✓ 10ml 移液管2支 ✓ 200ml 烧杯2个 ✓ 100ml 烧杯2个 ✓ 玻棒 1支 ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个 ✓ 吸耳球 1个 ✓ 记号笔1支 ✓ 试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl
六、α-淀粉酶酶学性质测定II
（米氏常数Km值的测定)
1.目的意义
由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提 出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学 中表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的、表示一个 酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。
V V max[S] Km [S]
1 Km 1 1
V V max
[S]
V max
用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线 在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为 1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：
Km=-1/x
3.仪器设备
3.1 试剂
➢ 10mg/ml 可溶性淀粉 1500ml ➢ 0.005% 碘液 2000ml ➢ 0.25M 醋酸溶液 ➢ 0.4M pH6.0醋酸缓冲液
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,
即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
• 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。
• 因此,米氏常数的单位为mol/L(在本实验中单位为g/L)。
• 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理 常数。