第八章 免疫标记技术

异硫氰酸荧光素(FITC) 呈黄绿色荧光; 巯基化藻红蛋白(PE) 呈橙红色荧光。
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激发光和发射光
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抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性
准确、特异、灵敏、快速地检测和定 位微量物质。
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优点：
特异性强，速度快，敏感性高，能 准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内 的定位分布。
缺点：
非特异性染色问题尚未完全解决,结果 判定的客观性不足。
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建立技术的必备条件
1． 荧光素 2． 荧光素与蛋白质结合物的制备 3． 荧光检测仪
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荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质。
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பைடு நூலகம்
荧光的种类
自发荧光
二
次荧光
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常 用 的 荧 光 素
返
回
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将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，
检测与抗原结合的特异性抗体。
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③补体荧光染色法：
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗 体），检测抗原抗体复合物。 可检测所有的抗原抗体系统，具通用性； 敏感性高；但操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制 备不方便。
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特殊染色法
① 双标记免疫荧光技术 ② 双色免疫荧光技术 ③ 反衬染色法
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①双标记免疫荧光技术
在同一标本中，可用两种不同颜色 的荧光标记抗体进行免疫荧光染色， 同时显示两种不同的细胞或同一细胞 上 不 同 类 型 的 抗 原 。 如 ： FITC （ 黄 绿 色荧光）和RB200或TRITC9（桔红色荧 光）。
（chemiluminescence immunoassay，CLIA） 5 免疫印迹法 （immunoblotting,
Western blot)
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第一节 放射免疫测定 法
（radioimmunoassay, RIA）
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放射性同位素(131I, 或125I)标记Ag或 Ab测定Ab或Ag,通过测定放射活性判断结果。 该法常用于测定微量物质: 如胰岛素、生 长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、 地高辛等药物以及lgE等。
第八章 免疫标记技 术
中国药科大学微生物与免疫学教研室 王慧
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免疫标记技术
免疫标记技术是指用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应;
三大标记技术: 同位素标记技术 免疫荧光技术 酶免疫测定
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标记免疫技术
1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF） 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA） 3.放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA） 4.化学发光免疫分析
样品(细胞)经各种荧光素标记的不同 抗体染色后可同时分析细胞表达的多种分 子。
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(1)免疫荧光法 ：
①直接法: 简单、快速、特异; 敏感性差。
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。
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② 间接法: 可检测多种不同的抗原抗体复合
物，具一定通用性；敏感性高; 但操作流 程长、干扰因素多。
（B）
+
Ag
↕ Ag-Ab
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RIA测定原理的定量示意图
Ag*
Ag
Ab
AgAb
游离Ag
B/F
B/T
∨∨∨
∨∨∨
‖‖‖ ∧∧∧
‖‖‖ ∧∧∧
6/2 6/8
∨∨∨ ‖‖‖
∨∨∨ ‖‖‖
4/4
∧∧∧
∧∧∧
4/8
∨∨∨ ‖‖‖ ∧∧∧
∨∨∨ ‖‖‖ ∧∧∧
∨∨∨ ‖‖‖ ∧∧∧
∨∨∨ ‖‖‖ ∧∧∧
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3/5 3/8
2/6 2/8
11
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第二节 免疫荧光 法 (immuno – fluorescence technique )
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原理
免疫荧光技术又称荧光抗体法。将抗 体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗 体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激 发下可产生荧光，借助荧光检测仪（荧光显微 镜或用流式细胞仪）测定或定位被检抗原或抗 体。
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5
Veterans Administration Hospital USA
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Bronx, NY,
6
与此同时，Ekins利用竞争性蛋白
结合分析技术测定甲状腺素获得成功；
开创了生物活性物质微量测定技术 的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。
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优点： ① 特异性强，即抗原抗体的特异性反应； ② 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g； ③ 操作流程简单易行，测量和数据处理自动化； ④ 样品用量少、无需复杂的提纯步骤； ⑤ 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。
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③反衬染色法
是用一种非特异染色来反衬一种免 疫荧光试剂的特异性染色。如：用 RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性 反衬标记，用FITC标记特异性抗体。
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流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)
是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机 技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一 体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大 小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细 胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物 学、分子生物学等学科广泛应用。
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②双色免疫荧光技术
如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI （碘化丙锭）。
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双重染色标本的单色和双色观察
WU
WIB
DUAL BAND
DAPI+FITC
WIBA
WIG
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WIB
FITC+PI
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多重染色标本的多色观察
（FITC+Texas Red+DAPI）
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荧光检测仪
（1） 荧光显微镜 （2） 荧光分光光度计 （3） 流式细胞仪 （4） 荧光偏振光分析仪
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荧 光 显 微 镜
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荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
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分类： （1）直接荧光法: （2）间接荧光法:
（3）流式细胞术(flow cytometry):
缺点： 需要昂贵的检测仪器；同位素污染。
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原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的特异性 抗体（或受体）的竞争性抑制反应基础上 的，最终形成的放射性标记复合物与被测 配体（或抗原）呈负相关，因而亦称竞争 性放射免疫技术。
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Ag* + Ab ↔ Ag*-Ab
（F）