免疫标记技术名词解释
免疫标记技术
手持端
鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗 尿液浸湿标志线 吸水材料
斑点金免疫层析试验结果判定
尿样
阳性
弱阳性
阴性
无效
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实验内容
• 1．免疫标记技术的原理和常用方法(电教) • 2. 免疫荧光技术（示教）
• 3．ELISA双抗体夹心法测AFP（操作）
• 4．胶体金标记技术（早孕诊断-双抗体夹 心一步法）（示教，操作）
实验报告
ELISA的原理、操作流程、结果及临
床意义。
免疫荧光技术
斑点金免疫层析试验
兔
实验目的要求
• 1．掌握免疫标记技术的概念及常用 方法； • 2．熟悉ELISA常用方法及临床应用。
免疫标记技术是指用酶、荧光素、 放射性核素、胶体金等标记抗体或抗 原用以测定相应抗原或抗体的检测技 术。常用的方法有免疫酶技术、免疫 荧光技术、放射免疫测定技术、免疫 胶体金技术等。此类技术具有特异、 敏感、快速，能定性、定量和定位等 优点，故在临床检验中得到了广泛应 用。
南开大学免疫学讲义-第十四章 免疫标记技术
免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。
因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。
根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术，放射免疫技术，免疫酶技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术和发光免疫测定。
近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。
各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。
在医学和其他生物学科的所究领域及临床检验上作中应用十分广泛。
第一节免疫荧光技术免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代韧，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时内于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。
直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。
Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。
一、基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。
然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。
免疫标记技术原理
免疫标记技术原理今天咱们来唠唠免疫标记技术这个超酷的东西。
免疫标记技术呢，简单来说，就像是给免疫系统的各种小卫士们或者它们要抓的小坏蛋们做个特别的标记。
你可以想象一下，在一个超级大的游乐场里（这个游乐场就是我们的身体啦），有一些小侦探（免疫细胞或者免疫分子）在到处找那些捣乱的小坏蛋（抗原，比如病菌之类的）。
可是这个游乐场太大啦，而且人来人往（身体里各种物质很多），要一下子找到那些小坏蛋可不容易呢。
这时候，免疫标记技术就闪亮登场啦。
那这个标记是怎么做的呢？这里面就有很多有趣的东西啦。
比如说有一种免疫标记技术是用荧光来做标记的。
就好像是给那些免疫小卫士或者小坏蛋们穿上了会发光的衣服。
这些荧光标记就像一个个小彩灯，在身体这个大游乐场里闪闪发亮。
当我们用特殊的仪器去看的时候，哇塞，那些被标记的东西就特别明显啦。
那些带着荧光的小卫士就可以很容易被我们发现，我们就能知道它们在哪里聚集，是不是在和小坏蛋打仗呢。
如果是小坏蛋被标记上了荧光，那它们就像暴露在灯光下的小偷一样，无处遁形啦。
还有一种是用酶来做标记的。
酶这个东西可神奇了呢。
它就像是一个小工匠，能够让一些无色的东西变成有色的。
我们把酶标记在免疫细胞或者抗原上。
比如说，有一个地方有小坏蛋，我们的免疫细胞就会去攻击它，然后这个被酶标记的免疫细胞就会在这个战斗的地方发生反应。
因为有酶在嘛，就像小工匠开始工作了，它会让周围的一些物质发生变化，产生颜色。
这样我们一看，有颜色的地方就知道是免疫反应发生的地方啦。
就像是在游乐场里，哪里冒烟了（有颜色变化就像冒烟啦，只是个比喻哦），哪里就是有事情发生的地方。
免疫标记技术还可以用放射性同位素来标记呢。
这就更酷啦。
放射性同位素就像一个带着神秘信号的小标签。
它会不断地发射出一种特殊的信号。
我们可以用专门的仪器去检测这个信号。
当我们把这个放射性同位素标记在免疫相关的东西上的时候，就可以追踪它们的行踪啦。
就好比是给小卫士或者小坏蛋们装上了一个小GPS，不管它们跑到身体的哪个角落，我们都能找到它们。
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
免疫标记技术的基本原理
免疫标记技术的基本原理
免疫标记技术是一种常用的细胞分子生物学技术，它是通过利用免疫原/抗原反应，将抗体与抗原或细胞内的标记物质结合在一起，以便识别、追踪、回收、测量和检测标记物质的手段。
免疫标记技术的基本原理相当简单，即在微小样品中检测特定抗原的方法。
它充分利用免疫系统的特性：抗体可以与外来的受体（抗原）结合，而不对正常细胞发生反应。
抗体与抗原结合时，会产生一种特殊的生物反应，该反应可以把抗体和抗原标记的某一特定的抗原分子联系起来，从而实现抗体和抗原之间的标记化效果。
免疫标记技术中首先要选择合适的抗体，并将其做好标记，然后将抗体接种到实验动物（如小鼠、大鼠）中，令其产生一种针对抗原特异性的免疫应答。
当抗体与抗原结合时，均会由于表位的分子吸引力而结合在一起，并且都会引发一系列的生物化学反应。
抗体标记物中的抗原与受体结合时，抗体也会受到外部影响而引发生物学改变，从而使其达到对目标抗原的特异性结合，从而提高标记物的特异性。
最后，在细胞或组织内观察抗体标记物所标记后的抗原或受体，以获得免疫标记技术的结果，从而实现抗原的高度特异性鉴定。
免疫标记技术的优势在于可以在细胞或组织的微小样品中检测出特定的抗原，而不需要大量的样品研究。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
第04章 免疫标记技术dun
许多物质都可产生荧光现象，但作为染料使用的有机化合物才能称 为免疫荧光色素或荧光染料。 常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素、四 乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等。
（1）异硫氰酸荧光素 （fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色 或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为 490~495nm，最大发射光波长520~530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。
缺点：影响因素多，若操作不当会引起较强的非特 异性荧光染色。
②透析法：先将待标记的蛋白质溶液装入透 析袋中，置于含FITC的0.01mol/L pH9.4碳 酸盐缓冲液中反应过夜，然后透析除去游 离色素。最后低速离心，取上清。
适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。
优点：标记比较均匀，非特异染色也较低。
二、免疫荧光显微技术
基本原理
使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面 的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗 体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景 上可见明亮的特异荧光。
（一）标本的制作 保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封 埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至 临近细胞或组织间隙中去。 标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接 触和镜检。 标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗 去，有传染性的标本要注意安全。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重 标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但 荧光效率较低。
③寄生虫感染诊断，间接荧光抗体染色法有 非常广泛的应用。 间接免疫荧光试验（IFAT）是当前公认的 最有效的检测疟疾抗体的方法。常用抗原 为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。 IFAT对肠外阿米巴、尤其是阿米巴肝脓肿 也有很高的诊断价值，所用抗原是阿米巴 培养物悬液或提取的可溶性抗原。
免疫标记技术-精品
其主要优点是： ①人眼对黄绿色较为敏感， ②通常切片标本中的绿色荧光
少于红色。
2、四乙基罗丹明
（rhodamine,RIB200）
橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定， 可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595nm～600nm，呈橘红色 荧光。
3、四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamineisothiocya nate,TRITC）
抗原
标记抗体
荧光 光原
直接法原理示意图 缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体
炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测
(一)间接法 将抗体(一抗)与标本中的 抗原结合,再用FITC标记的二抗染色。
抗原
抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
2、间接荧光法
将组织或细胞上的抗原直接与相 应抗体（不标记荧光）结合，此为 第一抗体，再把能与第一抗体特异 结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗 体加入，此为荧光标记的第二抗体， 在荧光显微镜下观察荧光。
紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大 吸引光波长为550nm，最大发射光波长 为620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配 合用于双重标记或对比染色，其异硫氰 基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
二、荧光免疫标记技术原理和方 法
（一）原 理 荧光免疫技术是用化学方法使荧光素 标记的抗体（或抗原）与组织或细胞 中的相应抗原（或抗体）结合，进行 定性定位检查抗原或抗体的方法。
【材 料】
1、 大白鼠肝组织印片。 2、 病人血清。 3、 荧光标记抗人IgG。 4、 丙酮、PBS、缓冲甘油 (PBS+等量
甘油)。 5、 阳性血清和阴性血清。
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
荧光免疫标记技术
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理
以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
将荧光素作为标记物与已知的特异性抗体以化学方法结合， 形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物 仍保留着抗体的活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它 与相应的抗原特异结合后形成的复合物上就带有一定量的 荧光素，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧 光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应 抗原进行定性、定位或定量的检测
FITC标记方法： 搅拌法：
适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记时 间短、荧光试剂用量少，但此法所受影响因素较多，若操作不当会 引起较强的非特异性荧光染色出现。 直接标记法 间接标记法 改良法
透析法：
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
荧光抗体的鉴定（特异性和敏感性鉴定）
效价 抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者 较为理想。 荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算
f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越 少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于 活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。
异硫氰酸荧光素(FITC)
四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm 呈橙红色荧光 与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色 其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低
第九章 免疫标记技术
（3）固相法
将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结 合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经 温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。 优点：操作简便、快速
新的固相分离方法：
纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法
（4）吸附法
本法多用于小分子半抗原的放射克疫分析。 如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等 性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性 吸附的能力 应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时，将会限制大分子物质的吸附。 沉 淀 中：吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗体复合物 优点：操作简便、分离迅速 缺点：与一性丌强
第一节
放射免疫技术
一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型
一、放射免疫技术的原理
RIA是以放射性同位素标记抗原的一种 竞争性克疫抑制试验
第一节
放射免疫技术
一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型
二、放射免疫技术的基本条件
本法操作简便、稳定 易叐克疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使 非特异性吸附有较大发异，丏第二抗体消耗量大。
缺点：
（2）化学试剂分段沉淀分离法
利用盐类或有机化合物使反应液中的球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目 的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等
优点：
试剂来源广泛、 价格便宜
缺点：
影响因素多（温度、pH值、浓度等）
2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法
4. 特殊染色法
三、免疫荧光技术的基本类型
1. 直接荧光抗体染色法
2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法
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免疫标记技术名词解释
免疫标记技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术。
它利用特异性抗体与待检测的分子结合，然后利用这些抗体上的标记物（如酶、荧光剂或放射性同位素）来检测和定量目标分子的存在和表达水平。
下面是一些常见的免疫标记技术及其解释：
1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：在组织切片或细胞上，利用抗体与特定抗原结合，再利用染色剂（如酶、荧光剂）将目标抗原可视化，从而研究和分析细胞或组织中特定蛋白质的表达和定位情况。
2. 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）：通过与荧光素结合的抗体，将特定蛋白质或其他目标分子在细胞或组织中可视化。
这种技术不仅可以用于检测蛋白质的表达和定位，还可以用于研究细胞的功能、相互作用和信号通路等。
3. 免疫酶标记（Immunoenzymatic labeling）：利用酶标记（如辣根过氧化物酶-HRP）结合抗体，形成特定酶抗体复合物。
通过加入合适底物和显色反应，可以观察到酶的活性，从而实现对目标分子的检测和定量。
4. 免疫原位杂交（Immunohistochemical In Situ Hybridization，
IHC-ISH）：结合免疫组化和原位杂交的技术，可以同时检测细胞或组织中的蛋白质表达和基因表达情况。
通过使用标记有荧光或酶的核酸探针，可以在组织切片或细胞上可视化特定基因的表达位置。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：该技术利用荧光标记的抗体与细胞中的特定分子结合，经过流式细胞仪检测细胞的荧光强度和分布情况。
这种技术可以用于检测和分析细胞表面标记物、细胞周期、凋亡等多种细胞特性。
免疫标记技术的应用范围非常广泛，可以用于癌症诊断、药物研发、免疫学研究和疫苗开发等领域。
通过免疫标记技术，科研人员可以更加准确地了解分子的功能、定位以及其在疾病中的变化，从而为疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。