支原体污染相关知识

治疗方法：

1所以兽用的泰乐菌素

2用plasmocin等抗支原体的药物有效（invivogen公司）

3用巨噬细胞共培养有效（吞噬支原体）；

4个人认为是胞外污染微生物通过整合素粘附介导的信号传导引起的（有初步data支持假设）。

抗生素处理：如加入泰乐菌素等。

共培养法：与巨噬细胞共培养。

重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5周后，重复克隆2次。

过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤

还有人认为含DDX基序的外源多肽进入宿主细胞后，可以激活caspase3介导凋亡启动。

培养过程：所以我改用corning的带滤膜透气盖的瓶子以后好多了。那个瓶子和普通盖子的贵不了多少。泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。第二种方法：M-Plasmocin：InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。第三种方法：用BM-Cyclin-1、2，效果很好，但方法如下：细胞传代同时加BM-Cyclin-1 10μg/ml，37℃培养3天，加入BM-Cyclin-2 5μg/ml，37℃培养3天；（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，即可结束。否则加BM-Cyclin-1 20μg/ml，37℃培养3天，加入BM-Cyclin-2 10μg/ml，37℃培养3天。怀疑是支原体污染的就可以试试了，对细胞不会有太大影响。

第四种方法：可以用红霉素，但它不能完全根治支原体感染，停药后一段时间可以复发。第五：热灭活可以试试，41度10个小时，可以杀死支原体，是一种比较简单的方法，对细胞损伤不大。

用ATCC培养基培养过的细胞污染物中，菌落大小不一。可能还有对培养基不适应的一些没有培养成功的。实际上，不仅仅是鼠支原体，还有无胆甾原体、猪鼻支原体、植原体、口腔支原体和精氨酸支原体等等，还有挑单克隆测序时，还发现比对为未鉴定的支原体种类。所以，种类繁多。

图片跟楼主见到的一样。我们还做过很多支原体的细胞粘附实验，其实很多支原体（体型胖的更明显）在10倍镜下就可见的。并不是很小。

Hd的MycoScan支原体检测试剂盒分别检测了培养基，血清，以及细胞培养上清，PCR的结果是培养上清（+），培养基（-），血清（-）。用药典上的方法，VERO细胞染色结果跟PCR结果一致。

检测支原体污染的方法有很多种，包括支原体分离培养、支原体特异酶检测、RT-PCR检测以及DNA荧光染色检测。上述检测方法中，除DNA荧光染色检测外操作步骤相对比较烦琐并且所需时间较长。本支原体染色检测试剂盒是通过Hoechst染色来检测支原体的。本试剂盒的荧光染色可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。

invivogen公司的支原体处理试剂

1：抗生素处理：分别用青链双抗，硫酸庆大霉素，四环素，环丙沙星/哌拉西林，以及支原体特效抑制剂m-plasmocin处理细胞，清楚效果不佳；2：物理方式处理，42度培养12小时，清除效果也不佳；3：坚持每天换液，换液前用含高浓度抗生素的DPBS洗涤细胞2次，吸干液体后换新鲜培养基，能够一定程度缓解污染物对细胞生长的抑制作用，但是每天换液前仍能看到大量悬浮死细胞。（附注：我们一直使用的是无菌一次性耗材，进口品牌滤盖培养瓶，Gibco公司进口1640、胰酶/EDTA，DPBS等溶液，以及Hyclone 公司的胎牛血清等）

场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。

使用的培养基是进口的粉末培养基，就是直接加水（我们实验室用的是三蒸水）、调pH值、过滤后就能用的那种，但是因为要经过0.22的滤膜过滤，所以水没有经过高压灭菌，而0.22的滤膜是不能阻止支原体通过的，所以这一点让我非常怀疑；

胰酶是买的现成的，不存在配制时污染的问题；

血清是国产的优级胎牛血清，不需灭活，不知道信不信的过？而且加到培养基之前也用滤膜过滤了，去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，国产的很便宜，在超净台内打开，可直接往培养瓶里加，混匀，终浓度为10ug/ml，细胞连续用药两周，即OK。也可试20，10，5，高中低三个浓度，慎重些。本实验室多人试过，效果很好，且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，

稀释量很大，能用于大量大量的细胞，经济实惠，最穷的人也用的起。

在无血清培养基（DMEM+15%KSR）

支原体抗生素，M-Plasmocin，invivogen

∙价格：￥1480.0

∙ 1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，并且用剪开内皮的那套剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，没有冲洗冲洗去血，直接拿到实验室。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头、四肢，并在解剖显微镜下彻底除去内脏，

否则得到细胞杂细胞太多，将其余胚胎转移到35或者60mm平皿中PBS洗涤3-4次（每次用一套），留少许PBS在平皿中，用眼科剪将其剪碎。

3.加入胰酶3-4毫升消化3-4分钟（轻轻吹打）后，让组织块稍沉淀一分钟左右，弃去上清（据

说第一次消化下来的细胞活性低），然后重复上面消化步骤，不过把得到的上清转移到盛有8ml

左右培养液的离心管中中止消化，这样消化2-3次。

4.将收集到的细胞用200目尼龙滤网过滤后，1000rpm离心5分钟收集细胞。

5.细胞沉淀用培养基（具体数量根据情况而定）悬起，细胞计数。

6.3×106细胞悬浮于10ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

∙我觉得可能是你的培养基配方有问题，如果你用的是液体的DMEM应该选择含有Hepers的，如果用的是干粉的DMEM应该额外添加Hepers，25mM/L。我曾在培养其他细胞的时候遇到过类似问题，加入Hepers后有显著改善。

∙

温度是不是稳定于37度？CO2浓度是否准确？另：MEF对温度很敏感），还有可以用好一点的serum，当然有条件可以排除一下支原体感染。

祝好！