根癌农杆菌介导的植物基因转化技术

实验7 根癌农杆菌介导的植物基因转化技术

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。图1是植物表达载体pBI121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以β－葡萄糖苷酶（β－glucuronidase,Gus）为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。

图2－1 Ti质粒载体pBI121图谱

实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。

一、试材与用具

1．植物材料：烟草无菌苗

2．农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI121

3．主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇床等。

二、方法步骤

1．试剂的配制

（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。

（2）烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA

（3）烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA

（4）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

（5）羧苄青霉素（cb）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

（6）链霉素（Sm）母液：100mg/ml，过滤除菌，－20℃保存。

（7）X－gluc（5―溴―4―氯―3―吲哚―β―葡萄糖醛酸）溶液（1ml）：称取0.5mg X －gluc，加入1～2滴N，N－二甲酰胺（DMFA）使之完全溶解，再加入980μl磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、10μl铁氰化钾（5mmol/L）、10μl亚铁氰化钾（5mmol/L），搅拌混匀后加入1μl Triton X - 100、X－gluc溶液应现用现配。

2．农杆菌培养

（1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含100mg/L Sm和50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。

（2）活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。

（3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MS液体培养基悬浮至OD600=0.2～0.5，准备感染用。

3．外植体的侵染及共培养

（1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液中，感染10min～20min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。

（2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d。

4．选择培养

将共培养的外植体转移到含500mg/L Cb和100mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。

5．继代培养：每隔2～3周继代一次，并逐渐降低Cb的浓度至200mg/L。

6．生根培养：待培养筛选的抗性芽长至1～1.5cm时，切下并转入含有200mg/L Cb和75mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。

7．转基因植株的Gus基因检测

（1）从具有卡那霉素抗性的烟草植株上，剪取幼嫩叶片，放入0.25ml的小离心管中，加入适量的X－gluc溶液，叶片全部浸泡在染液中，盖好盖子防止挥发。

（2）37℃保温，染色2h可看到蓝色，染色过夜。

（3）依次用70%、80%、90%和100%的乙醇脱色，直至绿色褪去。

（4）观察转基因植株叶片与未转化植株叶片的颜色。

三、作业和思考题

1．简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。

2．根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素。

（刘风珍）