双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

电泳完成，得到凝胶
含有各种长度DNA分子的溶液
放射自显影
固定凝胶 真空抽干 放入 X射线片夹
与照相机 原理相似， 利用射线 使胶片感 光，然后 通过显影 过程把 “像”显示 出来。
电泳完成，得到凝胶
得到X射线片
阅读测序结果
一般是从下往上阅 读X射线片上的显 影区带，即从测序 引物的5’端读向 3'端。
分成四管 双 双 脱 脱 氧 氧 腺 胸 苷 苷
双 脱 氧 胞 苷
乙二胺四乙酸， 一种二价金属 离子螯合剂， DNA聚合酶对 Mg2+浓度十分 敏感。
wk.baidu.com37℃下反应5min后加入 EDTA使DNA聚合酶失活
带引物的模板单链DNA 含有各种长度DNA分子的溶液
聚丙烯酰胺凝胶电泳
95℃加热 变性
冰上冷却 点样 开始电泳
操作步骤
1．制备单链模板与引物退火 2．链延伸---终止反应 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4. 放射自显影
5. 阅读测序结果
制备单链模板与引物退火
双链DNA 单链DNA 单链DNA
加加 热入 ，引 退物 火，
带引物的模板单链DNA
链延伸---终止反应
EDTA
核素标记的dNTP
双 脱 氧 鸟 苷
双脱氧末端终止法
测序的原理
主讲：氧气yun
Frederick Sanger
双脱氧末端终止法
DNA聚合酶不能从 头合成子链
如果dNTP的3’碳上 没有羟基 ddNTP——双脱氧 核苷酸
基本原理：
DNA复制
ddNTP的结构
聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA复制的特点
酶：DNA聚合酶 底物：dNTP
模板：单链DNA 引物：需要
引物的作用：提供3’羟基 末端
ddNTP的特点
ddNTP 3’位不是OH，但5’磷酸基 团正常。 DNA聚合酶不 能够区分dNTP 和ddNTP。 ddNTP参入到寡 核苷酸链的3’末端 后，DNA链的延 长会被迫停止。
聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
精度相当高！ 能分离长度达 300-500个碱基， 而差别仅一个 碱基的同系单 链核苷酸序列。