糖类物质的衍生化分离分析方法研究

南京理工大学
硕士学位论文
糖类物质的衍生化分离分析方法研究
姓名：徐瑾
申请学位级别：硕士
专业：物理化学
指导教师：王风云;李彤
20030301

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论文摘要
本文是国家“十五”攻关重大项目“科学仪器研制与开发”中“色谱仪与专用部
件的研制与开发”子课题的部分工作。
近年来，随着人们对糖类物质生物功能的不断深入了解，糖类方法学研究已成为
当今化学家和生物学家的研究“热点”，而高效液相色谱技术又是糖类方法学研究的
重要组成部分。该论文选择I一苯基一3一甲基-5．吡唑啉酮(PMP)作为柱前衍生化试剂进行
糖类物质分离分析的研究。在前人的工作基础上，采用简化的柱前衍生化方法，使反
应时间缩短近1／3，减少了衍生产物的损失。优化选择反应温度，反应时间，衍生试
剂PMP和NaOH用量等衍生化条件，最终确立的衍生化方法条件温和，衍生化反应
产率高。使用质谱扫描确定反应生成1：2结构形式的糖．PMP衍生产物，无立体异构
体，并对衍生产物稳定性加以评价，结果表明PMP柱前衍生化方法能够满足实际样
品常规分析的要求。结合建立的衍生化方法与高效液相色谱HPLC，优化分离条件，
并选择紫外(UV)和电喷雾一离子阱质谱(ESI—MS)两种检测模式对实际样品中所
含的单糖进行分离分析，建立了5种单糖的常规定性定量方法。也采用毛细管胶束电
动力学色谱(MEKC)分离单糖衍生物，与HPLC分离的结果加以比较，说明了MEKC
和HPLC应用于单糖分离分析的特征，确立了分离模式选择的基本框架。PMP柱前
衍生法用于还原性双糖的衍生，同样能取得较好的结果。实验表明，建立的PMP柱
前衍生一HPLc分离一EsI．MS检测方法可以作为聚糖研究方法，能够很好的说明其
“结构单元”一摘要单糖的组成。
关键词：l一苯基一3一甲基一5一毗唑啉酮，高效液相色谱，柱前衍生，糖类物质，紫外检
测，电喷雾一离子阱质谱，毛细管胶柬电动力学色谱

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Abstract：
This thesis is a part of‘‘The research and development of chromatography instruments
and their special fittings”，which is a subresearch of mega—projects of science
research-“The research and development of chromatography instruments’’supposed by
Chinese Tenth Five-year Plan．
The important roles of carbohydrates in many biological processes has become more
and more recognized over the past recent year,thus，there are considerable interests in
carbohydrate research，of which high—performance liquid chromatography(HPLC)is an
essential analytical tool-In this paper,I—phenyl一3-methyl一

5．pyrazolone(PMP)．a
precolumn derivatization reagent，was used to study the analysis of carbohydrates．A
simplified derivatization method using PMP was developed．With the simplification．
one-third of the derivafization time was saved，meanwhile，the losing of derivatives was
decreased without any influence on property of derivatives．A systematic research was
carried out on the reaction time，reaction temperature，amount of derivative and cataIvst to
establish optimum mild derivafization conditions，under which higher production rate
was achieved．By Mass spectrometry,it was demonstrated that two groups of PMP are
introduced to each reducing carbohydrate to give a bis-PMP derivative，without causing
isomery In addition，the stability ofderivatives was evaluated．The resuIt indica沁d that the
precolumn derivatization method with PMP is quite suitable for routine allalyses of real
samples·So far this method has been successfully applied to HPLC analysis of simple
monosaccharides．A baseline separation of five monosaceharides was obtained under
optimized isocratic condition． Both UV detector and electrospray ionization．Mass
印ectromc仃y(ESI-MS)were selected to determine the monosacchafide composition in real
samples·Then a routine identification and quantification method has been established．
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Further，the PMP method was also well-suited for micellar electrokinetic chromatograph3,
(MEKC)，whose results were compared with those of HPLC to illustrate the characteristics
ofthese two methods，therefore，to help researchers to choose appropriate separation mode
The use of PMP method in reducing disaccharides gave good results．The present method，
which combined PMP derivatization—HPLC with ESI—MS，could be used as a research
method to study the structural units—specific monosaccharides of polysaccharides．
Keywords：1-phenyl·3一methyl一5-pyrazolone，High—performance liquid chromatography
precolunm derivatization，carbohydrate，Uv，electrospray ionization—
Mass spectrometry,micellar electrokinetic chromatography
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1．文献综述
1．1引言
糖类物质是自然界存在的一大类具有广谱化学结构的有机化合物，糖类物质不仅
是动植物的能源(贮能材料如糖元)和燃料，也是代谢过程的中间产物，在生物过程
中起着非常重要的作用，是除蛋自和核酸之外的又一类重要的生物大分子。但人们对
糖类物质的生物学研究远远落后于前两者，主要是因为糖的种类多。结构复杂且多为
异构体，存在着微观不均一性”J。
糖类物质根据功能基团的不同，可分为醛糖、酮糖、糖醇和糖醛酸四大类；依据
糖的还原氧化特性，又可以分成还原性糖和非还原性糖，醛

糖属于还原性糖，大多数
酮糖以及1,6脱水醛糖属于非还原性糖；根据糖残基数目的多少，糖类物质又可分为
单糖、寡糖和多糖。单糖可以依照其碳数的不同分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖和庚糖，
常见的单糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。寡糖是由少数(2—6个)单糖缩合
形成的聚合物，低聚糖通常是指20个以下的单糖缩合形成的聚合物，而多糖则由多
个单糖分子缩合、失水而成的。寡糖、低聚糖、多糖只是指一定数量范围内的单糖基
的聚合物，其中并无十分严格的规定，都可用通式(c6HloOs)。表示。寡糖和多糖还
能进一步分为直链、支链和环状糖以及Cl、B异头物等fI卅。已发现在激素机体、维
生素、生长素和其它各种重要分子中都含有寡糖。寡糖也存在于细胞膜中，寡糖链突
出于细胞膜的表面，使整个细胞表面均覆盖有寡糖，这可能是细胞间识别的基础。寡
糖中以双糖的分布最为普遍，由两个葡萄糖基组成的双糖有l 1个异构体，其中常见
的有麦芽糖、纤维二糖、异麦芽糖等，它们之间的差别是糖苷键的不同。多糖是自然
界中分子结构复杂且庞大的糖类物质，它们在动物、植物和微生物中起着重要的作用，
植物的骨架纤维素、动植物贮藏养分的淀粉、糖原，昆虫与节肢动物的甲壳质，植物
的粘液、树胶、果胶等都是由多糖组成的。多糖按其组分分类，有均一多糖和杂聚多
糖。通常所说的多糖都是指由不同的单糖分子或单糖衍生物与非糖物质组成的大分子
杂聚多糖，如蛋白聚糖、粘多糖以及目前许多人工提取的植物多糖等.”。
简单寡糖可直接制备成衍生物进行分析，对分子量较大的寡糖，与多糖相似，需
首先通过水解、Smith降解、甲基化反应等方法将其降解为相应的结构简单的单糖或
简单寡糖，再通过对降解产物的定性、定量测定，来确定其结构[12,13]。水解是比较常
用的～种降解方法，可以把大分子裂解成较小片段，是色谱技术用来确定多糖、寡糖
中各种单糖组分构成的前提。使用无机、有机酸在适当的条件下能使多糖、寡糖达到
完全水解，定量转变成相应的单糖。酸水解可以使用盐酸、硫酸或者醋酸、三氟乙酸
等。盐酸用于糖蛋白和含氨基脱氧糖的水解；硫酸用于中性糖的水解：三氟乙酸用于

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植物细胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解。甲酸、乙酸也常用于特定多糖的水解”“。
一般来说单糖和寡糖仅在主要基团．CHOH的构型排列上有所区别，使用一般方
法进行分离纯化以及纯度鉴别比较困难。传统的菲林法、二硝基水杨酸法等化学分析
方法以

及电泳法、光度法等，由于无法对体系中的各种单糖进行预先分离，所以得到
的只是单糖的总分析结果。酶分析法虽然检测灵敏度高，但受到特异性及样品中污染
物干扰的限制，所以这些方法近年来已较少使用Il”。
色谱法能够将多种糖逐一分离，准确地进行定性定量分析，因此在糖类物质的分
析中占有非常重要的地位。早期主要采用纸色谱法、薄层色谱法及柱层析法等经典方
法进行混合糖的分析，这些方法分辨率低、分析时间长、定量测定困难、难以实现自
动化操作。另外糖混合物在有机相中溶解能力较差也使得这些方法的应用受到了限制
【3l。比较而言，气相色谱(Gc)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等高
效分离分析技术在很大程度上避免了这些问题，自应用于糖类物质分离分析以来。已
使糖的相关研究得到长足的发展。随着这些色谱方法的不断成熟与完善，它们在糖类
物质的分离分析中越来越显示出优势。
1．2糖类物质的GC分析
气相色谱法(Gc)具有选择性好、样品用量少、分辨率高、灵敏度高等优点，但由
于糖类物质结构中通常含有NH，OH，SH等极性基团，这些基团的内氢键作用增强
了分子内部的吸引力，使得一般糖和糖醇具有沸点高、挥发性低、难气化、热稳定性
差等特点，采用GC分析时，通常需进行衍生化处理使糖类物质转变为易挥发的物质，
GC常用的衍生化试剂包括甲基化类、酰基化类、三甲基硅醚化类等[16-191。气相色谱
．质谱(GC—MS)在复杂糖类物质定性定量分析方面具有独特优势。例如，多糖样品
中的游离羟基通过甲基化反应全部被甲氧基取代得到甲基化多糖，经水解得到甲基化
的单糖混合物，用硼氢化钠还原，再通过乙酰化得到甲基化链状多羟基醇的乙酰衍生
物，应用GC．MS测定混合物，可了解多糖样品中单糖的组成及大致的分支情况【怕1。
近期出现的裂解气相色谱(Pyrolysis gas chromatography，简称PGC)[20,21】与质谱、
红外光谱(IR)或核磁共振波谱(NMR)联用技术已成为糖类物质结构鉴定中强有
力的手段之一，可增加鉴定的有效性和高速性。
1．3糖类物质的HPLC分析
与GC比较，高效液相色谱法(HPLC)分析糖类物质时不存在挥发性限制的问
题，同时HPLC的多种分离模式可满足大部分不同性质糖的分离分析，成为目前糖类
物质分析的最主要方法。
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1．3．{色谱模式
1．3．1．1离子交换色谱法
离子交换色谱法(HPIC)是目前糖类物质分析的主要方法之一，通过改变固定相
上离子交换基团类型可以获得不同的分离效果。阴离子交换分离，以氢氧

化钠为流动
相，使用脉冲安培检测对单糖、中性寡糖和唾液酸化的寡糖的分析具有高的选择性和
灵敏度，勿须衍生，可直接测定低浓度(pmol／L)的糖，因此得到广泛应[23-281。糖
类对阴离子交换固定相的亲合力按下列顺序增加：糖醇<单糖<寡糖<多糖。用阴离
子交换色谱法分离糖的一个优点是可以改变保留时间和洗脱顺序[23】。Lee[251通过实验
证实阴离子交换色谱中柱温对多种单糖分离度和保留时间的影响非常大，因此温度的
控制对单糖的分离非常重要，一般控制在17℃左右。Rikke等128】以氢氧化钠为流动相，
采取梯度洗脱同时分离食品添加剂中12种糖醇、单糖和双糖。
用于糖类物质分析的阳离子交换柱包括多种金属配位离子，如钨、铅和银等。这
些色谱柱包括多种分离机理，如配位交换、离子交换、离子排斥、正向和反向分配等。
根据所用的流动相和温度，以上述的一种和多种分离机理为主。如对单糖和二糖的分
析，一般在高温下(80"C)等度洗脱，用水作流动相。其选择性与阴离子交换不同，
大分子糖的保留时间小于小分子糖，还原单糖较大分予糖保留时间长【231。
1．3．1，2凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法(GPC)常用于大分子多糖的分析，其分子筛作用使得多糖按照
其分子的大小顺序先后流出色谱柱，因此可以通过一系列多糖的分子量．保留时间标
准曲线得出相应的分子量[29-31】。该方法用于测定多糖的纯度和分子量，具有快速、分
辨率高、重现性好等特点。GPC在测定各种多糖分子量的同时也用于制备性的分离
多糖，为进一步的结构分析作准备【l卯。目前最常用的商品柱是肚Bondagel柱系列和
TSK柱系列，可用水、缓冲液和含水的有机溶剂作流动相[211。魏远安等【32】分别使用
两种不同的流动相，在Bio—Gel TSK柱上测定多糖的纯度和分子量，认为葡聚糖(及
许多其它多糖)的柔韧可变性使得其在不同溶剂中的伸展、皱缩程度也不同，影响了
其在GPC柱中的迁移行为，直观反映在同一样品在不同流动相中测出的分子量有所
偏差，但偏差不大。
’，3。1．3糖专用分析柱
糖专用分析柱对糖类物质具有较好分离效果。糖专用分析柱一般通过空间排阻、
离子交换、配位交换、分配吸附等不同的模式组合有效的进行糖类分析，使用简便快
捷，但柱填料的制备比较复杂，通常价格昂贵。氨基键合固定相是糖专用分析柱中比

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较常用的一种固定相，氨基填料对糖有较高的分离效率，但由于自身的水解，固定相
上的氨基与糖的羰基之问易形成希夫碱，缩短了其使用寿命。氨基柱分析

糖类物质一
般用水和乙腈、甲醇的二元或三元混合溶液作流动相，配比视组分的多少、分子量范
围、结构组成等而定，还可采用梯度洗脱来改善分离情况、缩短分离时间【33’34】。采用
普通硅胶柱或C18柱，在流动相中加入有机胺作为改性剂对其进行动态修饰，可得
到与化学键合氨基柱柱效相当的动态修饰柱，且由于柱上吸附的有机胺不断得到更
新，分析柱可以长时间保持稳定弘”。这种方法不但保证了糖类分离的简便快捷，而且
克服了以往糖专用分析柱填料制各复杂的缺点。
1．3．2直接检测模式
目前HPLC中应用于糖类物质分析直接测定的检测器包括示差折光检测(RID)、
蒸发光散射检测(ELSD)、紫外检测(uV)、荧光检测(FD)、安培检测(AD)等。
1。3．2，1示差折光检测器
作为HPLC的通用型检测器，RID在糖类物质分析中应用非常普遍。RID属于浓
度敏感型检测器，当糖类样品迸样量在40～40001．tg范围内时，迸样量与峰面积呈线
性关系。RID具有中等灵敏度，其线性关系的最低敏感量一般为201．tg。如果要求测
定更低浓度的糖类物质，就必须使用灵敏度更高的干涉型示差检测器【3】。但由于RID
对压力、温度、流速及流动相组成的变化很敏感，所以不能采用梯度洗脱，限制了其
在糖类物质分析中的应用[36-39】。
1．3．2．2蒸发光散射检测器
与RID比较， ELSD工作的基础是溶剂和被分析物有不同的沸点，样品结构不
需具备綮外发色团和合适的折射率，对糖、甘油三酯等无紫外吸收的化合物的检测有
很高的灵敏度，基线稳定且不受温度影响，还可以通过梯度洗脱来获得更好的分离。
Yang[351等采用乙二胺动态修饰的硅胶柱，以水／乙腈为流动相分离饮料中多含的单糖
和双糖，使用ELSD检测，灵敏度非常高。ELSD也常与超临界流体色谱法(SFC)
联用来进行糖类物质的分析[40]o优化ELSD漂移管的温度可以获得最好的重复性和最
低检澳f限。
1．3．2．3二极管阵列检测器
单糖在远紫外188nm处有最大吸收值，188nm属于真空紫外区，已超出正常的
UV检测器的波长范围，无法进行正常检测，所以迄今为止，关于紫外直接检测应用
的报道极少。也有人使用二极管阵列检测器(DAD)进行检测，其区别于普通Uv
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检测器的最主要、最基本的特点是快速扫描被测组分的紫外吸收光谱，可以进行宽谱
带检测。Thomas等‘4”以Na2S04．磷酸盐缓冲液为流动相梯度洗脱，阳离子交换色谱
分离多糖降解产生的饱和及未饱和的寡糖成分，DAD在214nrn处检测得到饱和寡糖
聚合度与摩尔消光系数之间的线性关系。对于不饱和寡糖

，在230rim处检测得到其
峰面积与理论计算浓度之间的线性关系。
’．3．2．4脉冲安培检测器
因为阴离子交换分离是在碱性条件下完成的，检测方法必须与之相匹配，用金电
极的脉冲安培检测器(PAD)适合这个条件：在碱性条件下。金电极的表面能为糖的
电化学氧化反应提供一个反应途径[231。方法的选择性好，可检测pmol级以下的糖类
物质，而且不需衍生反应和复杂样品的纯化过程【42I。为避免用于糖类分析时氧化产物
对电极的不可逆污染，PAD重复使用三种电势(三重脉冲)一工作电势E1，清洗电
势E2，还原电势E3112]。由于糖类物质的分离主要是基于离子交换机理，所以PAD
检测与离子交换色谱联用方法的研究更多地着重于流动相的pH值、柱温等条件的选
择12814¨“。虽然PAD检测无需衍生，但是必须注意样品不被其它物质污染，以防干
扰PAD的检测。但是在分析糖蛋白水解产生的单糖和寡糖时，PAD同时能检测到水
解副产物氨基酸和肽，在一定程度上影响了分析结果的可靠性。Kotani等1451在这种系
统中加入了荧光检测器，荧光试剂只与寡糖发生反应，避免了其它物质的干扰，不但
提高了寡糖分析的灵敏度，使得分析结果更可靠，检测限达到pmol级以下的水平，
而且可用来进行寡糖结构的分析，成为用于糖类物质研究的又一种新的色谱技术联用
方式。
1．3．3衍生化方法
衍生化方法可以使糖类样品转变为具有光学活性的物质，使检测信号增强，提高
检测灵敏度，某些种类的糖类物质经衍生反应后结构改变，极性随之变化，使原本难
以分离的成份可以用简单的、人们熟悉的分离模式分离开来。常用衍生化试剂有紫外
和荧光两种，具有荧光基团的物质一般都能吸收紫外光，所以通常的荧光衍生化试剂
可以同时用紫外和荧光检测器进行检测。HPLC中的衍生模式主要有两种：柱前衍生
和柱后衍生。
1．3．3，T柱前衍生
柱前衍生是在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进行分离和检测，
其优点是通常无需考虑衍生反应的动力学因素，衍生化试剂、反应条件和反应时间的
选择不受色谱系统的限制，衍生产物易进一步纯化，不需附加的仪器设备。缺点是操

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作过程较繁琐，容易影响定量分析准确性．且衍生反应形成的副产物可能对色谱分离
造成较大干扰从而严重影响分析结果的重复性‘46，471。但由于使用柱前衍生化方法衍生
效率高，所以柱前衍生仍是目前糖类物质分离分析方面最常采用的方法之一。
氨基毗啶(2．AP)用于糖类物质衍生的研究开始得比较早，至

今仍被广泛采用。
它能通过还原性胺化作用衍生中性糖和氨基糖，生成的衍生产物能同时采用紫外和荧
光进行检测。但是过量的衍生化试剂，以及一些反应副产物的吸收波长与衍生产物非
常接近，必须在检测前除去【48’捌。荧光检测较紫外检测来说灵敏度较高，所以目前
2-AP衍生糖类物质更多地采用荧光检测，检测的激发和发射波长分别为320nm和
400hm[5们。目前研究者多将其用于糖蛋白中的N．连接寡糖的定量分析和结构分析
150-551。Tomiya等【531使用AP衍生法分析了糖蛋白中N．连接寡糖的结构，结果证明寡
糖的保留时间与其聚合度(主要表现在葡萄糖基团的数目上)相互联系，为研究寡糖
的结构提供了必要的信息。Lee等154】应用同样的AP衍生法证实了糖蛋白中的N．连接
寡糖类型一般可分为M．(甘露糖)型、X一(木糖)型、F．(L．海藻糖)型以及z．(其
它)型。天然组织样品经肼解和酰基化作用能产生N．糖苷键型糖，Fujimoto等口51采
用AP衍生结合HPLC的方法对这类N一糖苷键型糖结构进行了分析，得到了人体血
浆或脑部组织中N．糖苷键型糖的二维结构图。对于分子量很大的多糖，常将2-AP衍
生与体积排阻高效液相色谱结合使用，进行多糖的分离以及定量分析【551。
但是2-AP通常有以下缺点：(1)糖类物质结构的不同导致衍生反应方式的不同，
反应条件难以控制；(2)因为这类衍生化试剂的第一位氨基团有位阻现象和电子钝化
的现象，所以与糖结合时会导致去糖基化作用，干扰糖的分析。使用时必须考虑这些
因素，尽量避免其对检测造成的干扰[50】。
氨基苯甲酸酐类衍生化试剂如氨基苯甲酸(2．AA)无上述氨基吡啶类衍生化试剂
的缺点，无论糖类物质是否带有保护基团，都能与其反应生成具有紫外基团和亲水性
的衍生产物，使得糖类物质的分离分析更为简单，是一种无选择性、有效面灵敏的衍
生化试剂，尤其适用于RP—HPLC分离【5“。2-AA同样可以用于荧光检测，检测的激
发和发射波长分别为230nrn和425nmt571。Meyer等㈨使用带亲水基团的C18反相柱
分离分析了10种包括中性糖、氨基糖以及糖醛酸的混合物，并使用紫外和荧光同时
对它们进行检测。但是2一AA固有的负电荷使得它更适用于电色谱分析，所以有关
HPLC的研究相对较少。
在HPLC中，人们更多地使用同样具有苯胺基团的2．氨基苯甲酰胺(2．AB)，2-AB
荧光衍生已成为许多糖生物实验室的标准方法之～【59j。Bigge等㈣通过实验证明2-AB
经优化的还原性胺化作用后，能有效衍生糖类物质，产生的背景信号可以忽略，没有

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检测到任何去

糖基化现象，证实该衍生化方法对糖的性质无选择性。所以目前已将
2一AB衍生广泛用于各种复杂糖类物质的结构分析，如糖苷类川、寡糖类162,631以及糖
蛋白类{64^5、。
Tran等[641将2-AB用于酪蛋白糖大分子肽(Caseinomaeropeptide，CGMP)肼解
产生的N．连接寡糖的分离分析，乙腈／甲酸铵作流动相，基于糖分子大小的差异导致
其亲水性不同的原理，使用氨基柱进行2-AB衍生寡糖的分离，以验证CGMP的糖基
化程度。Kinoshita等【65】参照2-AB衍生化方法衍生了粘多糖(包括软骨素、类肝素、
干磷脂等)硫酸盐(Sulfated glycosaminoglycans，GAGs)中产生的糖类物质，其中2-AB
衍生的未饱和的软骨素一双糖或干磷脂／类肝素一双糖能在氨基柱上得到很好的分离，检
测限达到pmol级。
Kitagawa等【661也分析了GAGs中产生的上述糖类物质，但他们使用的是另一种荧
光衍生化试剂2．氨基吖啶酮(2．AMAC)，以磷酸二氢钠为流动相在氨基柱上对未饱
和的于磷Jh／类肝素．双糖进行了分离。2-AMAC作为一种灵敏的荧光试剂可以用于单
糖、中性多糖∽681以及糖蛋白的研究【69】。2-AMAC荧光衍生化试剂灵敏度高，用于
多糖物质分析时速度比一般方法快，但其衍生过程比较繁琐，反应难于控制，在糖类
物质研究中的应用并不多见。
其它的氨基苯甲酸酯类荧光衍生化试剂还有6．氨基喹啉基一N一羟基琥珀酰亚胺氨
基甲酸酯(6．arninoquinolyl·N．hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC)1701和对．氨基苯
甲酸辛酯(p-aminobenzoic octane ester,ABOE)””等。
酰肼类化合物中的．CONH．NH2基团能与还原性糖中的醛基反应生成具有荧光吸
收的腙类化合物，因此这类化合物可用作糖类物质的柱前衍生荧光试剂1721。已有文献
报道的这类衍生化试剂有N，N一二甲基氨基萘．5一磺酰肼1731，4’一N’N．二甲基氨基．4一偶
氮苯磺酰肼【74】，3-羟基．2一萘甲肼【7 5J等，但糖与这些试剂衍生后通常会产生两个峰，
使分离复杂化，所以相关的研究进行得并不十分深入。芴甲氧基羰基氯(FMOC．CI)
克服了以往酰肼类试剂的缺点，衍生反应的副产物很少且过量的衍生化试剂及水解产
物在糖衍生物之后流出，不影响糖的分离(如有必要也可以通过戊烷萃取除去反应中
过剩的衍生化试剂)，所以无需任何预处理就可以直接进入HPLC系统进行分离，检
测的激发和发射波长分别为270和320rim[76,77,78]。由其合成的芴甲氧基羰基肼(FMOC．
胼)可以与还原性糖在～定条件下衍生形成稳定的在360nm处有紫外吸收的FMOC．
糖腙衍生物。林启山等[791综合前人的经验，同时采用FMOC．肼及FMOC．C1对包括
葡萄糖、半乳糖、木糖、氨基葡萄糖等十种单糖进

行衍生。其中FMOC．肼作用于中
性糖，FMOC—CI作用于氨基糖，两种衍生化方法能使被衍生糖带有相同的FMOC荧

硕“}：论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
光基团，用相同的色谱分离条件和相同的荧光检测条件进行分离分析，网对测定了胎
球蛋白和转铁蛋白中寡糖链的单糖组成。
FMOC—CI的硼酸盐络合物在紫外254nm处有吸收，所以糖的FMOC-CI衍生物也
常在硼酸盐缓冲液作流动相的条件下进行紫外检测阳m。Zhang等㈣同时使用
FMOC—C1及FMOC．肼对多种氨基糖和还原性糖进行衍生，并利用此分析结果对蛋白
水解液中的单糖进行了定性。虽然FMOC一肼衍生产率高且衍生产物稳定，具有高灵
敏度、低检测限的优点，但由于它只能与还原性糖反应，因而限制了其使用范围。
目前出现一种新型的荧光衍生化试剂3．乙酰胺基．6．氨基吖啶
(3-acetamide一6．aminoacridine，AA．AC)，结合了上述两种试剂的优点，尤其适用于pmol
级N，连接多糖的分析，其衍生物的荧光强度是2-AMAC的两倍，而且正相和反相
HPLC都可对其进行分离㈧。
苯氨基硫代甲酰类物质能与氨基键合，生成在254nm具有强烈紫外吸收的物质，
常用于氨基糖的检测，一般采用醋酸铵缓冲液，乙腈／甲醇作流动相．在C18柱上进行
分离【821。Spiro等【931尝试将中性糖转变为氨基糖，然后与苯基异硫氰酸盐(PITC)发
生衍生反应生成PITC-糖衍生物，成功测定了糖肽或糖蛋白中的单糖种类。
近年来出现的对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)是一种适合于所有类型糖的衍生化试
剂，方法灵敏度高，且可以消除由于糖类物质末端还原基团的旋光作用所形成的对偶
物。几乎没有任何衍生反应副产物，衍生化试剂峰在最后流出，不对检测产生干扰，
所以衍生反应后的物质可直接迸样，克服了以往衍生化试剂衍生后处理步骤繁琐的缺
点【83，84]。
大多数衍生化试剂都是基于还原胺化反应，衍生过程中使用酸催化，反应时间长，
可能导致不稳定基团如唾液酸残基和硫酸根的释放，影响下一步分析f861。与它们相比，
1一苯基一3-甲基·5一吡唑啉酮(PMP)可以与还原性的糖在温和条件下反应，无需酸催化，
不会引起去唾液酸化的作用，产物无立体异构体，在紫外245nm处有强烈的吸收[87】。
糖经PMP衍生后，其疏水性提高的同时，衍生产物带电，就可以使用多种分离模式
对其进行分析哺“89】。PMP运用于糖类物质的HPLC分析，能够得到较好的分离和检
测结果，通过方法的不断完善，已经能够降15种中性、酸性和碱性的醛糖进行分离
印1。目前，PMP衍生法除了成功运用于单糖分析外，对低聚糖的分离也很有效。
其它的

紫外柱前衍生化试剂还有甲氧基苯胺【901、对硝基甲苯氯【9JJ、2,4．二硝基苯、
6一氨基喹啉、苯甲脒等。

硕士论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
1．3．3，2柱后衍生
柱后衍生是在色谱分离后，于色谱系统中加入衍生化试剂及辅助反应液，与色谱
流出组分直接在系统中进行反应，然后检测衍生反应的产物的方法。在分离柱和检测
器之间连接一个小型反应通道，反应混合物以恒定的速度流过，使得衍生反应的操作
简便、重现性好，并且可连续反应便于实现分析自动化，因此引起了许多糖分析专家
的兴趣【461。但由于反应是在色谱系统中进行的，对衍生化试剂、反应时间和反应条件
均有限制，需要通过控制反应通道的尺寸、流动相的流量以及反应通道的温度实现在
特定温度下特定时间内反应的要求147]。
糖类物质紫外柱后衍生方面的研究开始得比较早，使用的试剂种类也比较多。糖
类物质柱后衍生比较经典的方法之一是使用含有某些显色试剂(如苯酚、地衣酚、葸
酮、咔唑、间二苯酚等)的强无机酸溶液，对单糖进行脱水、环化作用，使其转变为
糠醛。这种方法一般适用于还原性的或其它带有特定基团的糖类物质。六十年代中期，
这种方法第一次被用于糖类物质的柱后衍生，以硼酸盐缓冲液作流动相，糖类物质经
离子交换色谱分离后进行柱后衍生，不同种类的糖类物质采用不同种类的显色剂，实
现了柱前衍生所无法完成的定量分析要求，成为糖类物质分离分析研究的一个重大突
破【4”。然而这种方法的显著缺点在于使用的强酸具有腐蚀性，损耗流动相传送系统和
检测器。另外。使用的硼酸缓冲液与其它反应介质发生作用形成硼酸的结晶堵塞管道
[g Jj。
还原性的糖可以还原某些金属离子，如Fe”，cu2+等，如果某些化合物只能与低价
态的金属离子结合生成具有紫外吸收的螫合物，将这些化合物加入到糖类物质的溶液
中，就能实现糖类物质的金属离子柱后衍生一紫外检测法【471。铜氨络离子
([CufNH3)4(1-hO)2】2+)与单糖反应能生成在285nm或320nm处有紫外吸收的配合物。
George等【92】先将待分析的糖化合物在无定型硅胶柱上分离后，与泵入的铜氨络离子
反应后进入检测器检测，成功地分离检测了一些单糖和双糖。
紫外柱后衍生中也可采用酰肼类物质作为衍生化试剂。Vrdtny等I叫首次将这类物
质用于糖类物质的柱后衍生，分离检测了葡萄糖和果糖。5％的对羟基苯甲酰肼／HCI
溶液与O．75mol／L的NaOH溶液以10：75的体积比混合配制成反应试剂，与柱后流
出液在100 9C下反应，检测波长410nm。如果在衍生之前将溶液经

H+交换柱水解，
则该方法还能用于检测非还原性糖。如果将对羟基苯甲酰肼转化为对氨基苯甲酰肼，
可以提商衍生效率。Caceres等194]使用对氨基苯基酰肼捡测了一些实际样品(如奶粉、
糖果)中所含的果糖、麦芽糖、蔗糖等。
9

硕士论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
4-氨基．3．肼基一5一巯基一l，2’4一三唑能与醛糖中的醛基在碱性环境以及过氧化氢存在
的情况下发生环化反应，生成产物在550nm处有吸收。Nozal等195]利用其特性分离检
测了多种醛糖。
用于糖类物质紫外柱后衍生的试剂还有很多，例如乙醇胺f961、2-氰基乙酰胺f97】、
四唑蓝【981、百里醇、对氨基苯甲酸等，这些试剂使用时都各有优缺点。
乙醇胺、2一氰基乙酰胺在荧光柱后衍生中也比较常用。Nozal等[100]使用传统的乙
醇胺．硼酸体系作柱后衍生化试剂成功检测了阴离子交换柱(AminexA．25)分离得到
的酒中的11种糖。为了提高双糖和三糖的检测灵敏度，降低检测限，可以用对甲苯
磺酸水解柱后流出液，然后进行柱后衍生。检测的激发和发射波长分别为400rim和
445nm。
早期文献报道的作柱后荧光衍生化试剂使用的还有精氨酸以及脂肪胺类中的乙
二胺、2-氨基丙腈、氨基乙磺酸、p-甲氧苯基乙二胺[10ll等。但是这些试剂的缺点比较
多，人们还尝试其它类型的荧光试剂以更好的用于糖类物质的柱后衍生。
Kinoshita等[1021研究发现了多种糖的胍基类化合物都具有荧光，其中又以胍基乙
酸衍生物的荧光最强，并将其成功地应用于测定动物组织中的肌醇含量和肾衰竭病人
血液中的糖醇含量。用胍基类物质进行糖类物质的柱后衍生，具有灵敏度高、准确度
高的优点，能够迅速测定实际样品(如大豆、玉米等)中含有的糖类物质。另外这种
方法可以在一定程度上减小进样体积，延长色谱柱寿命。但这类化合物在水中的背景
吸收太大，且胍基乙酸稳定性很差，使用前需及时配制。因此他们又研究了背景吸收
小、较为稳定的脒基牛磺酸进行柱后衍生，12种单糖和糖醇的混合物先经阴离子交
换柱(Hitachi 3013N)分离，再与脒基牛磺酸一硼酸．高碘酸钠体系在150。C下发生反
应，检测的激发和发射波长分别为325nm和420nm。
脒基在碱性条件下与还原性糖中的酮羟基部分反应生成具有荧光的咪唑衍生物。
Coquet等‘1031使用苯甲脒柱后衍生分离检测了植物样品中痕量的还原性糖和中性糖，
Koimur等【l叫在此基础上通过优化苯甲脒柱后衍生反应的条件避开了糖类物质的端
基异构化产生双峰的问题，并降低了检测限。Hirotaka等‘1051使用梯度洗脱成功分离
了多种单糖和寡糖的苯甲脒衍生

产物。
通常衍生反应无法避免副产物的出现，在色谱系统中在线进行的柱后衍生，难以
通过有效的手段除去副产物的干扰，所以～般不能与质谱联用，限制了柱后衍生在分
析复杂样品中糖类物质组成以及进行糖结构研究中的使用。
柱前衍生和柱后衍生两者的主要差别在于前者是根据衍生物的性质不同而进行
lO

硕士论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
色谱分离，后者则先分离样品混合物，然后再通过衍生提高检测灵敏度。究竟选用哪
种方式，需视具体情况而定。为保持较高的反应产率和重现性结果，一般要求加过量
的衍生化试剂，这可能会干扰测定，对采用柱后衍生的方式不利。若对大量样品做常
规分析，则柱后衍生更适合于连续的自动化操作‘47l。
表1．3．1 HPLC中几种常见的衍生化试剂
衍生化试剂应用范围方法文献
氨基吡啶中性糖柱前衍生
(2一aminopyridine) 氨基糖紫外、荧光检测
48．55
氨基苯甲酸
中性糖
柱前衍生
r2-aminobenzoic acid) 紫外、荧光检测
56．58
氨基苯甲酰胺寡糖柱前衍生
(2·aminobenzamide) 糖苷类、糖蛋白紫外、荧光检测
59．66
氨基吖啶酮单糖柱前衍生
(2-aminoacridone) 中性多糖荧光检测
67．69
芴甲氧基羰基氯
氨基糖
柱前衍生
(9-fluorenylmethyl chloroformate) 紫外、荧光检测
72．80
芴甲氧基羰基肼
还原性糖
柱前衍生
(9-fluorenylmethyl hydrazine) 紫外、荧光检测
72．80
苯基异硫氰酸盐
氨基糖
柱前衍生
(phenyl isothiocyannate) 紫外检测
82．83
对氨基苯甲酸乙酯
所有类型糖
柱前衍生
(p-aminobenzoic ethyl ester) 紫外检测
83．86
1．苯基．3．甲基．5．吡唑啉酮
还原性糖
柱前衍生
(1-phenyl一3-methyl一5一pyrazolone) 紫外检测
86．89
金属离子螯合物
还原性糖
柱后衍生
(铜氨络离子) 紫外检测
47，92
对羟基苯基酰肼还原性糖柱后衍生
(p-hydroxybenzoic acid hydrazide) 少数非还原性糖紫外检测
93．94
乙醇胺单糖、双糖柱后衍生
(ethanolamine) 三糖紫外、荧光检测
100
脒基牛磺酸单糖柱后衍生
(taurocyamine) 糖醇荧光检测
102
苯甲脒
还原性糖
柱后衍生
(benzamidine) 荧光检测
103．105

墅主堡苎塑鲞塑堕竺堑皇垡坌童坌堑查鲨堡塑．——
1。3．4质谱检测
HPLC与MS联用技术将HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与MS独特的选
择性、灵敏度、分子量及结构信息结合于一体，在完成组分基本分离的同时还可以获
知各组分的结构，所以在糖类物质尤其是糖多聚物及缀合物的结构说明中起到非常重
要的作用，具有广泛的应用领域。多种离子化模式的质谱，例如快原子轰击电离质谱
(FAB)[106,1071、解吸化学离子化质谱(DCI)Dos]、

基体辅助激光解吸质谱(MALDI)
[109,110】茅口电磁性共振质谱(ESP)[1111等都可以有效地用于糖类物质的直接检测，而无
需任何衍生步骤。
胡亚男等.21在HPLC分离后，将电喷雾离子捕获质谱(ESI-MS)与MS串联对
中药及食品中的糖进行检测并对其裂解方式进行研究。构成糖蛋白的糖肽连接键有多
种类型，ESI离子源解离．MS与LC结合，用于糖蛋自的定量分析时，可以比较N．
糖苷键型和O一糖苷键型中糖基的分配方式，从而对它们的异构体进行研究.31。
Miyako等[1141使用相同的方法分析了促红细胞生成素中糖肽的结构，发现其中有三种
N．连接寡糖和两种0．连接寡糖。
酶解后的N一连接多聚糖，经甲基化作用后，使用MALDI—MS进行分析具有很高
的重现性，实现了多批次连续分析质量控制的可能性。Stahl等[110]结合使用
MALDI—MS和HPAEC初步测定了植物细胞中分泌的蛋白质和寡糖的结构，首次将
MALDI．MS作为植物组织的微探针。Harvey等11151结合反相HPLC和MALDI—MS分
析卵清蛋白中多种糖蛋白，结果显示糖蛋白中释放出大量的N一连接寡糖，通过结构
分析，认为卵清蛋白上的杂糖链末端成员主要是甘露糖，另外，糖蛋白中还含有五个
支链以上的聚糖。
但是天然的糖(尤其是寡糖、单糖)具有极性和热不稳定性，很难挥发，离子化
的效果不是很好，这种情况下，可以先将简单糖衍生以改善其性质，再进入质谱离子
化。常用的这一类衍生化试剂有2-AP，ABEE，PMpt“61及其甲氧苯基同系物，2一氨
基乙硫醇(2．aminoethanelhiol，AET)[1171，2-氨基苯硫醇(2．aminobenzenethi01．ABT)，
1,2．二氨基一4，5．亚甲基二苯酚.81等。Suzuki等嗍同时采用ABEE、PMP、AET、ABT
对寡糖进行衍生，分别用ESI和FAB两种手段检测分析，结果表明，相对来就ABEE
和PMP衍生产物更适于进行ESI—MS和FAB．MS检测。对低糖基化水平的糖蛋白，
ESI-MS可以提供其分子中糖含量的可靠的定量信息，Rychlik等t“9l比较了8一氨基萘
一1,3，¨三磺酸二钠盐(8-amino—naphthalene一1，3，6．trisulfonic acid，ANTS)以及PMP
两种衍生化试剂在上述系统中的应用。结果表明ANTS衍生产物的ESI-MS检测灵敏
度低，该衍生化试剂更适合于电泳分离和荧光检测。

硕士论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
HPLC与MS联用还有一些技术难题有待解决，主要是色谱系统各种难挥发溶剂
的排除问题。诸如压力匹配、流量匹配、气化等问题的解决都依赖于液相色谱仪与质
谱仪之间的接口装置的设计【4“。
1．4糖类物质的CE分析
毛细管电泳技术(cE)以其高效、高灵敏度、快速简便的优点吸引了糖分柝学家
的注意。利用CE分离糖首先必须解决电荷问

题，但是除糖醛酸、唾液酸、氨基糖以
及一些硫酸化糖外，天然糖分子都呈电中性，不能在电场中迁移，用毛细管区带电泳
(CZE)、毛细管胶束电动力学色谱(MEKc)、毛细管凝胶电泳(CGE)和等速电泳
(CTTP)等模式都不易使之分离[120l。同时由于糖类物质一般缺少紫外或荧光生色基
团，也不易对其进行检测。因此，在糖的CE分离分析中往往要采用络合、解离、衍
生技术使糖带电，并有针对性地选用检测手段【n1．1221。
糖类物质CE分析中的直接检测法指不经衍生化反应直接测定，常用的有两种方
式，一是在高pH值下，用强碱确保糖的离子化．进行uv、荧光或电化学检测，一
般直接检测的检出限只能达到nmol水平。二是间接检测，以某些有紫外吸收的物质
(如山梨酸，NaoH)作为背景电解质，使无吸收的物质产生负吸收而进行检测，该
方法的选择性较差，灵敏度低，而且不易得到稳定的背景，所以应用受到限制11231。
络合技术中常用的络舍剂为硼酸盐，它能与糖形成带电络合物，对于这些络合物
能用CZE方法进行分离，在UVl95nm下直接检测。硼酸盐只与寡糖链的外周糖基作
用，且与两个颂式一OH形成络合物的稳定性远远大于与两个反式．OH形成络合物的稳
定性，所以通过硼酸盐络合，能对具有不同外层结构的寡糖链进行分析；而且由于硼
酸与大小不一的寡糖形成络合物时，每个络合物只带一个电荷，可以根据分子大小进
行分离。这对分析糖蛋白中大小及结构相近的寡糖具有非同寻常的意义。除了硼酸盐
外，也常用磷酸盐作络合剂，它们可以单独及联合使用[1241。
CE中常用的衍生化方法为柱前衍生，衍生化试剂大致可分为三种[125。26】：一种是
还原性胺类衍生化试剂，如氨基吡啶、2．氨基苯甲酸【删、ANTSfl28】等，这类试剂具有
产生电荷的作用，一般只能用于还原糖(如醛糖)的衍生；第二种是与氨基糖反应的
衍生化试剂，如t，2．二氯芳香化合物、芴甲氧基羰基氯(FMOC—CI)Csol；第三种是用
PMP或醛酮物质与醛糖进行反应，这一类衍生化试剂对唾液酸化的寡糖最为合适，
因为它们不会引起去唾液酸化作用[1矧。PMP能使中性的糖类物质带电，有人己成功
地采用这种衍生化方法在毛细管区带电泳(CZE)11291，胶束电动毛细管色谱(MEKC)
1130-1331，毛细管凝胶电泳(CGE)1134]，和离子交换电动色谱(IXEKC)[135]等多种毛
细管电泳的模式中进行糖类物质的分离分析。在柱前衍生的基础上．Taga等11361又发

硕士论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
展了毛细管中衍生化的方法，虽然理论塔板数和衍生物产率要明显低于柱前衍生化方
法，但可以在很大程

度上提高毛细管电泳方法的重现性。
在糖类物质CE分析中，还广泛应用激光诱导荧光检测(LIF)，它灵敏度高，检
出限趋近于单分子水平I”71。LIF也使用柱前衍生法，常用的荧光试剂与高效液相色
谱中的荧光衍生化试剂基本相同，其中最有效的衍生化试剂是ANTS[”8】和8-氨基芘
一1，3，6一三磺酸二钠盐(8．amh埒一pyrerLe．1，3,6-trisutfonie acid，APTS)[t3s]，后者在很大
的pH范围内都带有负电荷，且具有发色团和荧光特性，尤以L／F检测时灵敏度高。
1987年，Olivares等首次报导了CE．MS联用技术【l 39】。CE．MS在一次分析中可同
时得到迁移时间、分子量和碎片信息。FAB．MS可以显示碎片离子，但只能产生单电
荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI除了可以产生多
电荷离子，还能产生多电荷母离子的自由离子，从而获得更多的结构信息，尤其适用
于小分子分析。那些因为没有分子离子或无法使用FAB检测的大分子寡糖只有mmol
级，即使未经衍生也可使用ESl分析[140]。因此，ESI．MS成为当前分析大分子糖及其
缀合物的最好方法之一[141l。近年来又出现了ESI．四极离子阱(OIT)．MS[1421和ESI一四
极飞行时问(QToF)-Msfl43]等经过进一步改进的ESI，可以针对某些特定的糖缀合物
进行分析，得到更全面的分析结果。基体辅助激光解吸／离子化质谱．飞行时间
(MALDI-TOFMS)具有快速、准确、高灵敏度测定大分子多糖相对分子量的能力．常
用来分析衍生后的寡糖、多糖及糖蛋白【145,146,147]。ESI和MALDI-TOF质谱在分子量
测定的灵敏度、准确性和对复杂体系分析能力方面均比以前的技术有了显著的改善，
大大拓宽了质谱技术在糖分析中的应用，但仍存在不少问题需要解决。如，ESI的多
电荷离子势谱图解析复杂化且对样品要求高，不能有盐和表面活性剂：MALDI．TOF
分辨率低，结构信息有限，基体辅助的机理尚未搞清，其选择全凭经验‘12"。
CE-MS作为常规分析方法尚存在以下缺点：浓度灵敏度低，不如Lc．MS；不是
所有的cE分离模式都可方便地与MS联用；MS对CE分离缓冲液的限制较多。因
此需进一步研究分离能力强的cE技术和MS联用的可靠方法，研制新型的高效
CE—MS接口，适用于CE的各种类型的缓冲液.21。
1．5结论
综上所述，GC、HPLC和CE方法在糖类物质分析方面都有应用，不同的体系可
以得到较好的结果，选用何种色谱模式进行分离及选择相应的合适的检测方法要视所
分析糖类物质的具体性质丽定。相对面言，液相色谱可以方便地通过改变分离模式和
选用色谱柱满足不同性质糖的分离，而且有多种检测方法能够与其联用以满足定性和

定量的要求，是目前糖类物质分析中最主要的手段。随着新型、高选择性HPLC固定

硕¨仓文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
相，高灵敏度衍生化试剂以及质谱等高效检测技术的研究与发展，HPLC在糖生物学
研究中的地位将会愈加重要。

硕上论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
PMP柱前衍生化方法的确立
2．1引言
如1．1所述，无论对哪种糖进行分析，必须首先将分析的对象与其它糖分离开来。
但是，一方面，糖的种类较多，多为同系物，结构近似，而且通常同时存在于一个样
品中：另一方面糖类物质几乎没有光学活性，最常用的光学型检测器直接使用困难，
示差折光检测器则灵敏度低。结合上述两个方面的原因，并综合灵敏度、选择性等方
面的问题考虑，人们多通过衍生化方法将糖类物质转变为具有光学活性的物质，然后
再进行分离分析。衍生化方法不但能使衍生物吸收紫外光，或具荧光，使检测信号增
强，提高检测灵敏度，甚至能改善其化学性质，作进一步结构鉴定，如质谱、红外或
核磁共振等；还能在一定程度上提高其在高效液相色谱(HPLC)上的分离特性，或
者使衍生产物带电，改善其亲水性、疏水性，以应用于多种分离模式。
根据1．3．3中对文献报道的多种紫外衍生化试剂的比较，多数衍生化试剂进行糖
类物质衍生的过程都比较繁琐，一般需要基于还原胺化反应，衍生过程中使用酸催化，
反应时间长，可能导致不稳定基团如唾液酸残基和硫酸根的释放，影响下一步分析。
与它们相比，PMP衍生糖类物质的预处理过程相对简单，所需的试剂种类比较少，
可以与还原性的糖在温和条件下反应，无需酸催化，不会引起去唾液酸的作用，且糖
．PMP衍生产物无立体异构体，易于离子化【s孔。鉴于PMP的这些特征，本章选用它
作为衍生化试剂进行糖类物质的研究，探讨柱前衍生在糖类物质色谱分离分析中的作
用。首先以葡萄糖为例，使用简化的PMP柱前衍生化方法对其进行衍生，达到了缩
短反应时间，减小产物损失的目的。系统考察了衍生过程中所涉及的衍生化条件的影
响，并通过质谱扫描的手段确定了衍生产物的结构，评价其稳定性。
2．2实验部分
2。2．1仪器
BS2103天平(北京赛多利斯天平有限公司)：电热恒温水浴锅(龙口市先科仪器
厂)；真空过滤器(天津市腾达过滤器件厂)；HI 9321pH计(HANNA，America)：
DZF一150型数显小型恒温真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)；3120AS超声波清
洗器(奥特赛恩斯仪器有限公司)；XW--80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。
UV200II紫外可变波长检测器，P200II高压恒流

泵，Echrom98工作站(大连依
利特科学仪器有限公司)：色谱柱：HypersilODS2 5 um(150×4．6mmlD)(大连依
利特科学仪器有限公司)；PU一1585高压泵(日本Jasco公司)；LCQDuo电喷雾一离子

硕J二论文糖类物质的衍生化分离分析方法研究
阱质谱(美国Firmigan公司)；工作站及数据处理系统(美国Finnigan公司)。
2．2．2试剂
PMP(99％，ACROS Organics，Belgium)：甲醇(色谱纯，山东禹城化工厂)；
gal、xyl、rham(生化试剂，上海试剂二厂)；gtu、m8．11(分析纯，上海试剂二厂)：
氢氧化钠(分析纯，沈阳化学试剂厂)；盐酸(分析纯，辽宁省医药经贸公司试剂厂)；
苯(分析纯，沈阳试剂一厂)；正己烷(分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)；
乙酸异戊脂(分析纯，辽宁省医药经贸公司试剂厂)；乙腈(色谱纯，Merck，Germany)；
三氯甲烷(分析纯，沈阳联邦试剂厂)；二丁醚(99％，ACROS Organics，Belgium)；
乙酸铵(分析纯，辽宁省医药经贸公司试剂厂)。
2．2．3色谱条件
2．2．3，1 HPLC条件
流动相：A一100mmol／L醋酸铵缓冲液(pH=5．5)：B一乙腈：A：B=78：22
流量：1．0mL／min；Uv检测波长：245nm
2．2．3．2 ES卜Ms条件
鞘气：40 unit；辅助气：0 unit；喷雾电压：4．5KV；加热毛细管温度：230。C
扫描模式：一级扫描
2．2．4衍生化过程
以glucose为例，将lmmol的glucose溶于5mL的NaOH溶液(O．3mol／L)中(低
温、密闭保存)，取该溶液150pL与100归的PMP／甲醇溶液(O．5mol／L)混合，在70
℃下反应30rain。反应后溶液冷却至室温后，加入1501．tL的HCI(0．3 mol／L)进行中
和，将中和后的溶液放入真空干燥箱中，100*C下减压烘干。烘干后的样品用2mL水
及2mL氯仿溶解，充分振荡后除去有机相，萃取过程重复3次。水相溶液经O．45 12
m滤膜过滤后，用水稀释至一定浓度，进样量10pL进行HPLC分析。
2．3结果与讨论
2．3．1衍生化方法的考察
已报道的方法中陋881，多采取以下的衍生化方法：含一定量糖类物质的水溶液经
过减压真空干燥，依次加入NaOH溶液和PMP／甲醇溶液，充分混合，于70。CT反应
30min或2h后，立即冷却至室温，反应液经稀HCl中和后进行真空干燥，干燥物用
水溶解，多次萃取后的水相再一次进行真空干燥，最后的干燥物用水溶解后过滤方可

堡主堡苎塑耋塑堕堕!!生些坌塞坌堑塑鎏塑塞——
进行色谱分析。这些干燥和萃取步骤以除去衍生反应中剩余的试剂和产生的杂质为目
的，虽然减小了分离分析过程中所受的干扰，延长了色谱柱的使用寿命，但同时也造
成PMP衍生化方法操作复杂，无法避免处理步骤中衍生产物的损失。也有人在衍生
过程中不采取任何干燥步骤，盐酸中和后的溶液直接进行萃

取，多余的衍生化试剂虽
然没有完全除尽，但是由于衍生化试剂峰在6种单糖的衍生产物峰前流出，所以并不
干扰分离分析，因而很大程度上简化了衍生化方法，将衍生产物的损失降至最小Il“J。
实验分别尝试了这两种方法。发现如果使用简化的方法，在man衍生产物的峰后
有一个小峰(PMP)，等度洗脱时两者无法达到基线分离，在一定程度上千扰mail的
测定(如谱图2．3．1a所示)。前后进行两次干燥后，能使PMP峰消失，但同时也导致
衍生产物的大量损失，繁琐的操作步骤也容易造成系统误差。通过多次实验发现只采
取一次干燥(即中和后溶液的干燥)，经充分萃取，PMP峰基本消失，不对分离分析
产生任何干扰。这样既达到简化实验步骤的目的，降低衍生产物的损失，使得定量实
验更加准确，又在最大程度上减小衍生化试剂峰的干扰(如谱图2．3．1b所示)。
-2 0 2 4 6 8 10 12 q4 16 18 { O 2 4 e 8 t0 口w 16 q8
ReldrlI／OnUrm州n)庸b蜘am㈣
(a) 蚴
图2．3．1 5种单糖衍生产物的色谱图
Fig 2．3．1 HPLC—UV chromatogram of the PMP
derivatives of5 small sugars
{(a)without drying proccss；(b)with one drying process
2．3．2有机萃取剂的选择
柱前衍生需要使用过量的衍生化试剂以保证反应充分进行。为了减小衍生化试剂
对分离分析的干扰，延长色谱柱使用寿命，必须在样品进入分离系统之前除去过量的
衍生化试剂。分别选取常用的有机试剂——苯、氯仿、乙酸异戊酯、正己烷以及二丁
醚作萃取剂，进行除去衍生反应中产生的杂质和残留衍生化试剂的实验研究。在相同
条件下使用同样体积的不同有机试剂进行萃取，表2_3．1同时比较了这五种有机萃取
剂去除干扰物的效果(用PMP剩余量表示)和对衍生产物的萃取率(用glu．PMP的
耐8i¨ Ⅺ●iiii m

堡主笙壅塑鲞塑堕堕塑生些坌堕坌塑查堕堕塞——
萃取率表示，即萃取后的样品溶液中glu．PMP峰的峰面积与未经萃取的样品溶液中
glu—PMP峰的峰面积的比值)。
表2．3．1不同有机萃取剂对衍生产物回收率的比较
．．．。。．．T—a——b 2．3．—1—Comparison of the effielencies of cleanup b：r solvent extraction．．．．—．
溶剂R。篡是赢，心裳筹磬彘， Solvent (菇) 。(％j
结果表明在5种有机试剂中，经三次萃取后，二丁醚的作用最佳。但比较而言，
氯仿的两相区别更明显，更有利于分层。氯仿用量为PMP的200倍(体积比)时，
三次萃取后PMP剩余率小于2％，同时glu—PMP的回收率最大可达到96．8％。对PMP
衍生的其它单糖，如man、gal、xyl等，氯仿的回收率也令人满意。如采用涡旋混合
器或者离心机等机械手段进行辅助萃取，通常只需一到两次萃取

，就可获得相当高的
回收率。在实验过程中发现5种有机试剂中，采用乙酸异戊酯两次萃取后，5种单糖
的回收情况基本一致(在82％～90％之间)。采用氯仿萃取分别进行一次、二次、三
次萃取，rham、glu、gal、xyl的回收率如表2．3．2所示。(man—PMP与PMP的峰非常
接近，不经萃取时，PMP峰对mall的峰部分重合，无法精确计算各自的峰面积，所
以未考虑mail的萃取率)。
一次萃取后，rham、glu、gal的回收率基本一致，xyl的回收率较低。二次萃取后，
rham的回收率减小，xyl的回收率增加。三次萃取完成后各单糖的回收情况非常接近
(在90％～96％之间)。综合各方面原因考虑，选用氯仿作萃取剂，萃取次数为3次。
表2．3．2不同萃取次数对衍生产物回收率的影响(氯仿)
Tab 2．3．2 The influ蜘ce of different extraction tim％to the efficiencies of
!!!!!!Pig!!!竺!!!巴2
萃取时间萃取率
Extraction 垦堑!!!型!堑!
times rham glu gal xyl
l
2
3
61．9
64．9
92．4
63．2
79．3
95．1
63．3
80．1
95．7
56．8
77．5
90 0
19

堡主堡苎堕鲞望壁塑堑生些坌堕竺!!!鍪堕壅一———
2。3。3最佳锈生化反应条佟懿{筵择
文献报道的PMP衍生化单糖的反应式如下"8钓
I
tic·--一OH
OH—CIH
’《一6h
I
CH 20H
gl“。03。PMp glu-PM P
圈zJ．1PMP与gIu的反应玄理式
F堙1,3．2 The stbrm}甜derIvatizatipa irFm+libl between PM甲rand酌u
以glu为基准物质，分别探讨了衍生反应过程中涉及的四个主要因素：反应温度、
反应时间、FMP和NaOH用量对衍生物产率的影晌。进行每～个因素的优化选择时，
固定其它因素不交。试验结果见图2．3．3(其中glucose的反应量恒定为1×10一t001)，
a。反应对溺鲍影嗡：搬撬文簌鹊箍巢设计实验，lm△1的单禚绍合2rnol的PMP t衍
生产物结构如图2．3．2所示)．衍生反应中一般要求衍生化试剂过量，所以将NaOH
和PMP的用量都定为5×104mol，反应温度为70"C，时间变化范围在10—120rain
之间。反_匝时间小于30min时，衍生产物产量随反应时间的增加而迅速增加，30min
时产量达到最大值，30mia以后，随着反应时阃的延长，产量开始下降，60min
以焉，蕃本不变(舀2，’k)。反应时间的延长并不能有利于干打生反应的充分进j亍。
反而会导致一些不明副产5|勿的生成。因此最佳反应时间为30min，
b．反应温度的影响：同样保持NaOH和PMP的用量为5×10一tool，反应时间为30rain，
温度变化范围在40--80。C之间。实验发现在j0—70。C范围内，衍生产物的产量随
着温度的蠼如面线性增加，离子'恩℃时。{6生物产量开始有跃降馁。可能电子反
应过程中衔生产物发生分解(图2．3．3b)。因此最佳反应温度为7Dc