酶组织化学

1. 钙钴法
β-甘油磷酸钠
Co++ 硝酸钴 酶底物 酶 PRP（磷酸） 与底物混合液 某金属离子结合 +某金属 金属置换 显色
AKP
磷酸酯 + Ca++
磷酸钙
磷酸钴 硫化胺 硫化钴（黑色沉淀）
2. Gomori 硝酸铅法
β-甘油磷酸钠
硫化胺
ACP
磷酸酯 + 铅
磷酸铅
硫化铝（黑色沉淀）
酶
酶底物
PRP（磷酸） 直接沉着 与底物混合液中 显色反应 金属离子结合
1. 检测方法的选择
2. 酶的保存与固定 一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片 -70℃长期保存 固定的目的： 1）保持组织细胞原有的形态结构 2）使组织硬化
常用固定剂
1、甲醛： HCHO 40%甲醛溶液的商品名称为福尔 马林，10%福尔马林 多聚甲醛:（HCHO)n，n=8〜100 4%多聚甲醛溶液 2、戊二醛：C3H10(CHO)2 2 〜4%戊二醛溶液 3、乙醇：CH3CH2OH 80%乙醇溶液
2. 一般原则 1. 对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布
2. 所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细 胞中
3. 所选底物最好只能被一种酶催化分解 4. 所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反 应试剂的穿透性
5. PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色 稳定产物 6. 所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合
酶的种类
1. 2. 3. 4. 5. 6. 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶
二. 酶组织化学反应的基本知识
（一）酶的特性
水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂
有机溶剂不同程度降低酶的活性
易受温度影响，对热耐受性弱
对干燥耐受性强
（二）酶的定位
酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位
(五) 酶组织化学的主要步骤
1. 酶的固定（fixation）
2. 酶的特异性反应（specific reaction）
3. 在最适条件下,酶反应产物的沉着 （precipitation）
4. 使沉着物具有可见性（visualization） 组织/细胞 制作切片 酶反应（孵育） 显色
封片
镜检
（六）各步骤注意问题
（六）各步骤注意问题
5. 孵育反应 A. 孵育液配置 B. 孵育的温度和时间: 37℃ 15-30min C. 切片孵育法 -切片孵育 -漂浮孵育
（六）各步骤注意问题
6. 酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂
采用无底物的孵育液
过固定或加热
用针对目标酶的激活剂
改变孵育液底物 选择最适PH 酶细胞内的定位差异
应用: 可显示胆碱酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非 特异性酯酶 例如：
吲哚酚酯
吲哚酚
酯酶+水 氧化作用 O2
吲哚酚+ RCOOH
靛蓝（兰色沉淀）
四. 酶组织化学的应用
1. 了解组织、细胞的代谢活动 2. 细胞类型的判断
3. 了解细胞定位
4. 用于肿瘤的研究
5. 用于免疫组化和杂交组化的显示手段
4. 举例 α-萘基磷酸钠
磷酸酶
磷酸氢二钠 + α-萘酚
α-萘酚 + 坚牢兰 5. 应用
偶氮染料沉淀
可显示ALPase, ACPase, 酯酶, 肽酶, β-葡糖苷酶等
转肽酶,
(三) 联苯胺色素法
用于显示过氧化物酶 原理: 酶 无色联苯胺
脱氢
有色联苯胺
联苯胺褐
(四) 四唑盐法
用于显示氧化酶和脱氢酶 原理:
方法： 推注，滴注
滴注步骤： 1、开胸 2、暴露心脏 3、自心尖剪开左心室 4、插入灌流针至主动脉弓 5、固定灌流针 6、快速注入冲洗液 7、先快后慢注入固定液 8、慢注毕，取材
恒冷箱切片 1、骤冻 2、防冰晶 防冻剂：10〜30% 蔗糖溶液 电镜切片的制备 （一）包埋前染色切片法 1、恒冷箱切片 2、振荡切片机切片 （二）包埋后染色切片法
一. 概述
酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质; 酶组织化学
利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并 通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞 中内源性酶的活性及其定位的方法;
酶组织化学发展历史
1. 1868年 Klebs 过氧化物酶； 2. 1939年 Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶； 3. 电镜酶组织化学 1955年 Scheldon将电镜与酶组织化学结合 起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和碱性 磷酸酶； 4. 免疫酶组织化学 1970年 Sternberger 酶标抗体法 目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种
（六）各步骤注意问题
7. 孵育后操作 光镜: 酶孵育后进行后固定 镜检 电镜: 孵育后, 后固定 后染色 电镜检查
脱水
封片,
脱水
超薄切片
（六）各步骤注意问题
8. 人为产物及其原因 酶或与检测有关物质的扩散
最终反应产物的扩散
吸附现象
反应阴性
三. 显示酶的组织化学方法
（一）金属离子沉淀法
一般用于显示磷酸酶
然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应， 生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在
第一反应：酶促反应 底物 酶 初级反应产物（PRP）
第二反应：捕捉反应 PRP + 捕捉剂 终反应产物（FRP）
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PRP弥散： 1. 底物在酶催化下水解的速度 2. PRP在缓冲液中的弥散系数 3. PRP与辅助物反应的速度 应选择合适的底物和辅助物, 减少弥散 捕捉剂的浓度（<1mg/ml）
5‘-核苷酸酶——浆膜 ATPase——肌球蛋白 细胞膜 线粒体
(三）酶组化的基本条件
同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位
保证反应产物的特异性 *影响酶活性的因素：
温度 PH值 抑制剂 激活剂
（四）原理及一般原则
1. 基本原理 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间 产物（即初级反应产物）
一、组织化学的基本概念
H­E染色 铅法（ATP酶）
H­E染色
醛复红染色
一、组织化学的基本概念
（三）组织化学的基本原理
化学试剂 + 拟检物质
（组织切片或细胞涂片）
化学反应
反应产物沉淀↓（有色）
（拟检物质所在处）
一、组织化学的基本概念
（四）组织化学技术的用途
酶 组 织 化 学 （enzymohistochemistry）
（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）
1.原理 偶氮偶联 不溶性 底物混合液 酶 PRP与 重氮盐结合 偶氮色素
2. 方法
同时偶联法 后偶联法
3. 常用底物
萘酚AS-BI
萘酚AS-MX 常用重氮盐 坚牢兰RR 坚牢红TR 六偶氮副品红
萘酚AS-D
萘酚AS-TR 坚牢兰B 坚牢紫B 六偶氮新品红 坚牢红RC
异戊烷或乙烷等
液氮 (－197℃) 或干冰 （-78℃） 组织块
恒冷箱切片： 组织取材和固定或不固 定→骤冻（液氮，–
198℃；干冰，–78℃；
冻结金属座，–30℃）
→ 切片（恒冷柜）
→ 粘片（载玻片）
→ 晾片
→ 组织化学染色程序
（六）各步骤注意问题
3. 切片制作: 切片厚度<40um
4. 缓冲液选择 缓冲液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机制相同的物质 C. 注意漂洗用缓冲液的渗透压 D. 漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同
四唑盐或双四唑盐 与底物混合液
被还原
脱氢酶
+2H
氢离子与 无色四唑盐结合
红色或兰色的沉淀
常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物
TTC

蓝四唑盐 BT 新四唑盐 NT 四唑氮蓝 NBT 四氮四唑盐氯化物 TNBT
(五) 靛蓝反应
原理:底物被酶分解为二个初级反应产物,其中 之一可在一定条件下形成不溶性的靛蓝
组 织 化 学 (Histochemistry)
姜玉峰
石河子大学医学院组胚教研室
一、组织化学的基本概念
（一）组织化学的提出
（二）组织化学的定义
在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态
时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观察某些
化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和 定量及其变化规律; 定性，定位， 定量; 组织原位，显微镜