western blotting 蛋白质印迹实验流程
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白印迹法的基本过程
蛋白印迹法的基本过程什么是蛋白印迹法？蛋白印迹法（Western blotting）是一种用于检测特定蛋白质在样品中存在与否以及其相对丰度的实验方法。
它基于免疫学原理，通过将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并利用特异性抗体的结合来检测目标蛋白质的存在和浓度。
蛋白印迹法具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，常用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域。
下面将介绍蛋白印迹法的基本过程，包括准备样品、电泳分离、转印、固定和检测等步骤。
1. 准备样品蛋白印迹法开始前需要从待检测的生物样品中提取蛋白质。
样品可以是细胞培养物、组织样本、血清或其他体液，根据不同研究目的选择不同样本类型。
提取蛋白质的方法可以采用细胞裂解或切碎组织等方法，以释放蛋白质。
在提取过程中，添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂等辅助试剂可保护蛋白质免受降解。
此外，还需对提取的蛋白质进行测定，以掌握蛋白质的总量。
2. SDS-PAGE电泳分离样品中提取到的蛋白质会在电泳分离中根据分子量（大小）被分离开来。
常用的电泳方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
首先，将样品混合物加入到聚丙烯酰胺凝胶的样品孔中。
电泳时，电场会使得蛋白质带电并向电极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质将被解离成线性状态，并获得相同的电荷密度。
蛋白质在电场作用下，由负极向正极迁移。
而根据蛋白质分子量的不同，迁移速度也不同，从而实现了蛋白质的分离。
3. 转印转印（blotting）是将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到含有蛋白吸附性纸膜的固相材料上的过程。
这个步骤是为了方便后续的特异性抗体结合和信号检测。
转印分为湿法转印和半干法转印两种方法。
湿法转印需要将蛋白分离凝胶与固相材料（通常是尼龙膜或聚乙烯膜）浸泡在缓冲溶液中，然后通过电流使蛋白质从凝胶中转移到固相材料上。
半干法转印采用蛋白质毛细作用实现分离凝胶与固相材料之间的转接。
4. 固定转印完成后，需要对蛋白质进行固定以防止其在后续步骤中的流失。
western-blot实验操作步骤
western-blot实验操作步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
可按照以下步骤操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳（1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
（2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
（3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。
硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
Western blot 蛋白印迹 操作规程 操作步骤
蛋白印迹技术(Western blotting)印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。
缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。
这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质（10％～20％）。
电泳印迹可以更快速有效的进行转移。
这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成"三明治"形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。
转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进 一步检测。
印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是抗鼠Ig G的抗体。
蛋白质印迹(Western blotting)
蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。
3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。
4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。
它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。
根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。
3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。
4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。
5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。
一抗与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。
二抗与一抗结合。
7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。
8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。
目标蛋白会出现特异性的条带。
9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。
以上是免疫印迹分析的基本流程。
根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
甲醇能使SDS与蛋白分离，使蛋白充分转到膜上，甲醇浓度越高SDS 与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白 从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20% 甲醇的另一个作用是降温，电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发， 电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快
三：转膜（PVDF膜）
• PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质 的最佳用膜。这种疏水膜呈均一控制的孔结构， 具有极强的吸附生物分子的能力。与硝酸纤维素 膜相比，PVDF膜具有易于操作，染色性能好、 抗溶剂能力强和信噪比高的特点，提高了检测的 灵敏度。其开放的孔结构使其容易接近被吸收的 蛋白质，并去除背景上没有吸附的探针。可以说， 它是免疫检测理想的印迹膜。
作用：使蛋白样品浓缩 对于浓缩胶来说，pH6.8可以 通过甘氨酸和和氯离子的作 用产生压缩，从而使蛋白条 带压细。
总体积（ml）
3（两块胶的量）
二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）
配胶过程要点： 灌制浓缩胶
插入梳子
• 制分离胶时10%AP加入后迅速混匀再加TEMED制胶，沿壁灌注，灌 注时尽量不要产生气泡，如有气泡，用移液器将气泡吸出，留出浓缩 胶所需空间（梳齿长再加1cm）。 • 覆盖水层于分离胶溶液上，夏天将制胶器放室温20min，冬天放37度 灌制分离胶 培养箱 20min-30min 隔绝空气 • 待分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微 倾斜模具，检测凝胶是否聚合），倒掉并用滤纸吸干水 • 在已聚合分离胶上直接灌注浓缩胶液体，立即插入加样梳（缓慢插入， 避免产生气泡）。将凝胶在室温或者37℃静置20-30min（视具体情 况而定），直到浓缩胶完全凝固。
二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳）
• 将电极插头与电源上对应的电极连接，电流应流向正极； • 将电压调至80V，预计20min后待染料迁移至分离胶时， 将电压调至100V，60min待溴酚蓝到达凝胶底部时，停止 电泳，关闭电源，从电源上拔掉电极插头，从平板中取出 凝胶。 • 电压可以根据具体情况作适当调整，但是不能电压过大， 电压过大易导致内槽因电泳液温度过高出现胶融或条带变 形。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
westernblotting实验操作步骤讲解
westernblotting实验操作步骤讲解蛋⽩免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋⽩样本通过聚丙烯酰胺电泳按分⼦量⼤⼩分离，再转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。
WB 是进⾏微量蛋⽩质分析⽐较成熟的技术之⼀。
以下是总结Western Blot 操作⽅法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第⼀部分：蛋⽩样本提取制备蛋⽩样品制备是Western Blotting的第⼀步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取⽬的蛋⽩（通过采⽤不同提取⽅法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋⽩处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表⾯活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防⽌蛋⽩降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加⼊合适的蛋⽩酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等⼲扰分⼦（通过加⼊核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
⽅法的选择◆⾃⾏配制抽提试剂，根据⽂献⽅法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的⽅法提取。
Example 1：实验中提取肾脏总蛋⽩，具体实验过程如下：1.提前⼀天4℃解冻RIPA，⼀定要完全融化；配PBS（⽤于细胞试验则需⾼压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临⽤临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离⼼10min，取上清。
4.蛋⽩定量：取少量上清稀释30倍蛋⽩定量，然后计算出各样本原液蛋⽩浓度。
注意由于裂解液⾥含有较⾼浓度的洗涤剂，蛋⽩定量不能选⽤Bradford法，可以选⽤改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋⽩浓度均⼀化：根据蛋⽩定量计算的结果将各样品蛋⽩浓度调整⼀致。
western blot蛋白质印迹
3ml
1.9ml 75ul 75ul 8ul
7.5ml
免疫印迹 Western Blotting
操作步骤
lSDS-PAGE
灌胶 5%浓缩胶
H2O
30%丙稀酰胺 1 M Tris-cl 10%SDS 10%过硫酸胺
3.4ml
830ul 630ul 50ul 50ul
TEMED
8ul
5ml
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
(四)免疫检测
•显色（HRP、AP法) •化学发光(HRP、AP法)
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
主要内容：
一、印迹的概念和分类 二、印迹的流程 三、免疫印迹过程 四、免疫印迹技术的应用
免疫印迹 Western Blotting
二、印迹的流程
•探针 •固相载体 •印迹 •封阻 •探针作用
•显色或自显影
免疫印迹 Western Blotting
三、免疫印迹过程
免疫印迹 Western Blotting
蛋白质转移系统(protein transfer systems)
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
免疫印迹 Western Blotting
The Trans-Blot Plus Cell.
1.buffer tank and lid; 2.gel holder cassette and fiber pads; 3. Plate electordes; 4. Super cooling coil.
Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹
Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹一：蛋白质的提取1、取出细胞，倒去培养液，用PBS洗涤细胞一次，充分除去PBS液体，把细胞置于冰上。
配置细胞裂解液，细胞裂解液用灭菌水配置，然后按照1：100比例加入PMSF混匀，然后按照细胞的多少加入裂解液于培养瓶中，在冰上放置20min。
在此期间每隔3-5min摇晃培养瓶，让其充分裂解细胞。
2、裂解结束后，吸取裂解液于另一只1.5ml离心管中，于4℃13000r/min 离心15min。
3、离心结束后，吸取离心管内上清于另一只干净离心管中。
于-20℃保存。
4、根据上样量的多少，计算需要处理的样品，在处理样品时按照1：1比例加入2×buffer。
于100℃煮5-10min。
结束后短暂离心，于4℃备用。
二、主要试剂的配制：1、30%丙烯酰胺溶液：取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水至100ml，过滤，棕色瓶内避光4℃保存；2、1.5M Tris-HCl分离胶缓冲液，pH8.8 (4x)：取18.15g Tris，用1M HCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存；3、1.0M Tris-HCl在浓缩胶缓冲液，pH 6.8(8x)：取12g Tris，用1M HCl调pH至6.8，加水至100ml，4℃保存；4、电极缓冲液：pH8.3( 1x)：取28.8g甘氨酸，6.04g Tris碱，加10ml 10% SDS，加水至1L，室温保存；5、10% SDS溶液：取10g SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。
6、10%过硫酸铵溶液(APS):取0.1g过硫酸铵,加水至1ml,每次用前新鲜配制7、2X样品缓冲液 0.1M TrisCL，PH6.8；0.2M DTT；4%SDS；2%溴酚兰；20%甘油8、电转印液 pH 8.2-8.3：甘氨酸 14.42g，Tris base 3.02g，dH2O 800ml，甲醇 200ml， 1N HCL调定pH值至8.2-8.3，室温放置。
western blotting原理及步骤
western blotting原理及步骤
Western blotting，也称为蛋白质印迹，是一种用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等的技术。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合反应，通过将样品中的蛋白质进行电泳分离，然后转移到固相载体上，再与特异性抗体进行孵育，最后通过显色反应检测目标蛋白质的存在和位置。
Western blotting的步骤一般包括以下几步：
1. 样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，并进行浓度测定和保存。
2. 电泳分离：将样品中的蛋白质进行电泳分离，根据其分子量和电荷的不同，将蛋白质分开。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到固相载体上，常用的载体有硝酸纤维素膜、PVDF膜等。
4. 封闭：用特定的封闭液将膜封闭，以减少非特异性结合。
5. 孵育：将特异性抗体与膜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
6. 洗膜：用洗涤液将未结合的抗体洗去，减少背景干扰。
7. 显色：加入显色液，使抗体-抗原结合部位显色，从而检测到目标蛋白质的存在和位置。
8. 数据分析：对显色结果进行定量和定性分析，以获得目标蛋白质的表达情况和相互作用信息。
Western blotting具有较高的灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以半定量分析蛋白质的表达水平。
同时，Western blotting也可以用于研究蛋白质分子的相互作用。
然而，由于其步骤繁琐且易受干扰，Western blotting 的操作需要严格的质量控制和技术培训。
1。
蛋白印记操作流程
蛋白印记操作流程
蛋白印记（WesternBlot）是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测和分析蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
以下是蛋白印记的基本操作流程：
样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质。
对于细胞样品，通常需要将细胞破碎并溶解在裂解液中。
对于组织样品，可能需要将组织切成小块并加入预冷的裂解液进行匀浆。
然后，通过离心去除细胞碎片或未溶解的组织残渣，收集上清液作为蛋白质样品。
蛋白质定量：接着，对提取的蛋白质进行定量。
这可以通过使用蛋白质定量试剂盒或分光光度计等方法来完成。
蛋白质定量的准确性对于后续的实验步骤至关重要。
SDS-PAGE电泳：将定量后的蛋白质样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在一定温度下预热。
然后，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
电泳过程中，蛋白质会根据其分子量大小在凝胶中分离。
转膜：电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上。
这一步通常通过电泳或真空转移法完成。
免疫检测：转膜后，使用特定的抗体与膜上的蛋白质进行免疫反应。
这通常包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和再次洗涤等步骤。
一抗是针对目标蛋白质的特异性抗体，而二抗则是与一抗结合的标记抗体，用于后续的显色反应。
显色与结果分析：最后，通过显色反应（如化学发光或荧光检测）来可视化抗体与蛋白质的结合情况。
根据显色结果，可以分析目标蛋白质在样品中的表达水平和分布情况。
整个操作流程需要严格遵循实验规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，还需要注意实验过程中的安全事项，如佩戴防护眼镜和手套等。
western印迹法原理和流程
western印迹法原理和流程英文回答：Western blotting: Principle and procedure.Western blotting is a technique used to detect specific proteins in a sample of tissue or cells. It is based on the principle of antigen-antibody recognition.The first step in Western blotting is to separate the proteins in the sample by electrophoresis. This is done by running the sample through a gel, which separates the proteins based on their size and charge.The proteins are then transferred from the gel to a nitrocellulose membrane. This is done by placing the geland the membrane in a buffer solution and then applying an electrical current. The proteins will migrate from the gelto the membrane, where they will bind to the nitrocellulose.The next step is to incubate the membrane with a primary antibody. The primary antibody is specific to the protein that you are interested in detecting. The antibody will bind to the protein on the membrane.The membrane is then washed to remove any unbound antibody.The next step is to incubate the membrane with a secondary antibody. The secondary antibody is specific to the primary antibody. The secondary antibody will bind to the primary antibody, and it will also be labeled with an enzyme.The membrane is then washed again to remove any unbound secondary antibody.The final step is to add a substrate to the membrane. The substrate will react with the enzyme on the secondary antibody, and this will produce a colored product. The colored product can be visualized using a scanner or a chemiluminescence detection system.中文回答：Western 印迹法，原理和流程。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤1. 引言嘿，大家好！今天我们要聊聊一个非常酷炫的实验——蛋白质免疫印迹实验，或者说西方印迹（Western Blot）。
听名字就很高大上对吧？其实就是用来检测特定蛋白质的。
想象一下，你在寻找一颗珍珠，蛋白质就是那颗珍珠，而免疫印迹就是我们的寻宝地图。
别担心，我会一步一步带你走过这条寻宝之路，让我们开始吧！2. 实验准备2.1 材料准备首先，准备好你的材料，这一步可马虎不得哦。
你需要的东西包括样品（这可以是细胞、组织、甚至是你那杯牛奶），裂解缓冲液、凝胶电泳设备、转膜设备、封闭液、抗体（这个可不能少！），还有洗涤液和显色试剂。
听起来有点像是做饭，其实是很简单的，像是在调配一碗美味的汤。
2.2 样品处理接下来，我们要处理样品。
把你的样品和裂解缓冲液混合，轻轻摇晃，让它们充分融合。
接着，要把这些混合液放在冰上静置一段时间，简直就是在给它们来个冷静期，让蛋白质们沉淀下来。
然后，咱们要通过离心机把细胞的碎片和其他杂质去掉。
小心别把珍珠也扔了，哈哈！3. 电泳分离3.1 凝胶制备哎呀，这时候就要准备凝胶了。
其实凝胶就像是个筛子，能让小的蛋白质通过，而大的蛋白质则被挡住。
我们一般用聚丙烯酰胺凝胶，先把它溶解，放到模具里，等它固化。
固化的时候可以去喝杯茶，顺便欣赏一下这小小的“魔法”。
3.2 电泳运行凝胶固化好后，就可以把样品上胶了。
注意哦，别搞得稀里糊涂，把样品挤到槽里。
然后把凝胶放进电泳池，接上电源，开跑！这就像在赛道上，蛋白质们各显神通，争先恐后。
别着急，等到它们跑到适当的地方，再把它们捞出来。
4. 转膜步骤4.1 转膜跑完电泳，接下来是个关键步骤——转膜。
把凝胶和膜叠在一起，放在转膜装置里，接上电源，让蛋白质们转移到膜上。
就像是把书里的内容复制到你的笔记本上，确保每个细节都不漏掉。
转膜的过程可能需要一段时间，但别担心，慢工出细活嘛！4.2 封闭和抗体孵育转完膜后，我们要进行封闭。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
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细胞总蛋白的提取
（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS 约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度
（1）配制工作液
根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA 工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品
取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品
取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；
（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
（5）将96孔板取出后用酶标仪测定OD570nm值。
（6）根据标准品的OD570nm值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓度。
蛋白质变性
（1）根据预计将要上样的蛋白质样品质量（25μg-50μgμg，是蛋白质而定），取适量体积的蛋白质样品于预冷的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液（体积约为蛋白质样品体积的25%），通过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。
用封口膜将离心管封口，7000r/min离心点离样品混合液3s，使其混合均匀。
（2）将放置样品混合液的架子置于盛有适量dd H2O的磁盘中，用电磁炉加温至100℃，煮沸5min。
点离样品，使其混合均匀。
2.34.54. SDS-PAGE分离蛋白质
根据将要检测的蛋白质大小，首先确定配制10%的分离胶（10ml）：
dd H2O 4ml
30%Acr-Bis 3.3ml
1.0MTris-HCl（pH8.8）
2.5ml
10%SDS 0.1ml
10%AP 0.1ml
TEMED 0.005ml
将配置好的液体吹打混匀，灌胶，再用注射器将dd H2O缓慢均匀的加于分离胶上层，待胶凝固后（光下可见明显的水胶分离线）将上层水倒掉，并用滤纸尽量将水吸干（注意不要碰到分离胶）。
然后配制4%浓缩胶（3ml）：
dd H2O 1.8ml
30%Acr-Bis 0.4ml
1.0MTris-HCl（pH6.8）0.76ml
10%SDS 0.03ml
10%AP 0.03ml
TEMED 0.003ml
将配置好的液体吹打混匀后，迅速灌胶并马上插入梳齿，待胶充分凝固后放入垂直电泳槽内，加入电泳缓冲液，小心将梳齿拔出，每孔加入等质量变性蛋白质（根据不同的蛋白质具体的上样质量会有所变化，但相同蛋白质的上样质量始终不变）后进行电泳。
先采用80V恒压电泳约30min后，改用100V恒压电泳约2h（具体视溴酚蓝跑到胶的最底端的时间而定）。
2.34.6 转膜
（1）预先裁剪出大小适宜的PVDF膜和滤纸，尽量使PVDF膜面积稍大于凝胶，但不大于海绵。
（2）电泳结束后，将凝胶剥下，小心的将浓缩胶切除，将分离胶浸泡于预冷的转移缓冲液中约15min，洗去杂质。
（3）将PVDF膜完全浸泡在甲醇中约30s。
（4）在倒满转移缓冲液的塑料盘中依次加入转膜用的夹子（正极一侧在下，保持水平）、一块海绵垫、滤纸、浸泡好的PVDF膜、浸泡好的凝胶、滤纸和另一块海绵垫，整个操作过程中要不断赶走气泡，在夹紧夹子前要确认各层中没有气泡（否则会影响转膜结果）。
（5）将夹子放入电泳转移槽中，确认夹子的正负极与转移槽正负极相对，整个转移槽埋在冰中进行转膜。
根据将要检测的蛋白质分子量大小确定转膜时间，小分子蛋白一般为恒压80V，1.5h；大分子蛋白一般为恒压100v，2h。
（6）转膜结束后打开夹子，小心去除负极一端的海绵、滤纸和胶，在PVDF膜的右上角剪一个角以确定正面，然后取出，根据预染蛋白Marker标准判断转膜效果及目的条带的大致位置。
2.34.7 免疫反应
（1）封闭：将PVDF膜浸泡于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中（如要检测磷酸化蛋白，则需使用含5%BSA的PBST封闭液进行封闭），室温下摇床摇动封闭约1-2h。
（2）剪膜：依据预染蛋白Marker标准判断目的蛋白的条带位置，并将其小心剪下，膜的宽度应适当，并尽量保留周围可能出现条带的位置。
（3）一抗孵育：用5%BSA溶液将一抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将剪好的PVDF膜置于其中，稀释好的一抗应当至少没过PVDF膜。
4℃下摇床摇动封闭过夜。
（4）洗膜：室温下，用1×PBST在摇床上洗涤PVDF膜4次，每次10min。
（5）二抗孵育：根据一抗选择相应的羊抗鼠IgG二抗或羊抗兔IgG二抗，用含5%脱脂奶
粉的PBST将辣根过氧化物酶标记的二抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育槽中，将PVDF膜置于槽中，室温下摇床摇动孵育2h。
（6）洗膜：室温下，用PBST在摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10min。
2.34.8 显影
（1）用水冲洗好平板，将保鲜膜平整的铺于平板上，并用滤纸赶走气泡，将孵育好的PVDF 膜取出置于保鲜膜上，放置整齐，并用滤纸轻轻吸去PVDF膜上的液体；
（2）取适量ECL试剂A、B液等体积混合后滴于PVDF膜上，避光孵育5min，用滤纸吸去剩余的发光试剂，并将平板放入凝胶扫描成像系统中，根据荧光强度确定曝光时间（5s-30min）。
待成像后将图片以.tif格式保存。
（3）用灰度分析软件Quantity One软件对实验结果进行灰度扫描。
2.4 5 HDAC组蛋白去乙酰化酶活性比色分析试剂盒检测HDAC活性
（1）取对照组和实验组各50μg待测蛋白质样品，用ddH2O将其稀释，使终体积为85μl，并按0μM，1.25μM，2.5μM, 5.0μM浓度依次加入96孔酶标板中。
（2）加入10μl 10×HDAC Assay Buffer。
（3）再加入5μl HDAC Colorimetric Substrate，彻底混匀。
（4）在温箱中37℃孵育1h。
（5）加入10μl Lysine Developer并彻底混匀，终止反应。
（6）在温箱中37℃孵育30min。
（7）将96孔板取出后用酶标仪测定A450 OD450nm值。
将其转化为酶的活性值并进行统计学分析。
2.5 细胞周期及凋亡率检测
（1）收集实验组和各个对照组K562细胞5×106个，1000r/min，4℃离心5min，弃去上清。
（2）1×PBS洗涤细胞两次，1000r/min，4℃离心5min，完全弃去上清。
用手指轻弹细胞团，使其分散重悬。
（3）每管加入约1000μl预冷的70%乙醇固定细胞，边滴边用手指弹匀。
（4）置于-20℃冰箱中过夜。
再送往公司进行细胞周期及凋亡率检测。
2.6 统计学分析
2.6.1 所有数据均采用SPSS17.0等进行处理及统计学分析，并以P＜0.05为有显著意义的检测标准。
2.6.2 所有数据均用表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著意义的检测标准。