酶工程 第五章 酶、细胞、原生质体固定化PPT幻灯片
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß-D-葡萄糖＋O2
D-葡萄糖酸-1, 5-内酯＋H2O2
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
一、固定化酶的制备
早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固定化酶）
1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定义
限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是 指借助物理或化学方法将酶固定于水不溶性载体， 使得酶与整个流体分隔开，但仍能发挥催化效能 的酶制剂形式。
3. 固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）应有最小的空间位阻 （3）酶与载体必须结合牢固，稳定性好 （4）载体不与底物、产物或反应液发生化学反应 （5）成本要低，有利于生产自动化、连续化
4. 酶的固定化方法
酶的固定化
载体结合法 交联法 热处理法 包埋法
凝胶型 微囊型 脂质体 物理吸附 离子结合 共价结合
➢ 优点 ① 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整； ② 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现； ③ 酶失活后载体仍可再生。
➢ 缺点 ① 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不 一定呈平行关系； ② 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活 下降并污染产物。
物理吸附法固定化酶举例
载体
固定化酶
载体结合法
（1）物理吸附法
➢ 原理 ： 通过氢键、疏水作用和π-电子亲和力等物理作用， 将酶固定于水不溶性载体上。
➢ 制备方法: a. 静态法 (static procedure) b. 电沉积法 (electrodeposition procedure) c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反应器装载法 (reactor loading process)
酶工程原理和基本过程
菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→ 酶成品
酶的固定化 原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ←
↓ 反应液→ 产品提取→ 产品
固定化酶发展历史
1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象 （蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。
20世纪50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基 苯乙烯树脂为载体，分别制成固定化的胃蛋白酶、 淀粉酶等。
制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。
.
2 优点
固 定 化 酶 的 特
点 缺点
（1）提高酶稳定性 （2）可反复或连续使用；易于和反应产
物分开；酶的使用效率提高，成本降低 （3）酶反应过程可严格控制 （4）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；
增加产物收率，提高产物质量 （5）较游离酶更适合多酶反应
（1）固定化时酶活有损失 （2）增加了生产初始成本 （3）只能用于可溶底物且较小分子 （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应
活性炭
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶
纤维素
α-淀粉酶、β-淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶
脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
亮氨酸氨肽酶
胰蛋白酶、核糖核酸酶
麸素 硅胶
β-淀粉液化酶 磷酸化酶
酶
(2) 离子结合法
载体 ➢ 原理：酶通过离子键结合于具有离子交换基的
水不溶性载体上。 ➢ 载体：
Hale Waihona Puke Baidu
➢ 常用载体
a. 无机吸附剂： 硅藻土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟 基磷灰石、活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般 很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。
b. 有机吸附剂： 纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量 一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸 酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。
阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤 维素、混合胺类-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE) -纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 阳离子交换剂：如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素 柠檬酸盐、IR-200、Dowex-50等。
➢ 制备方法
在一定pH、温度、离子强度等条件下 ① 将酶液与载体混和搅拌数小时 ② 将酶液缓慢流过处理好的离子交换柱
20世纪70年代后期：固定化细胞技术 1982年，日本首次用固定化原生质体生产谷氨酸 近年来，随着纳米材料和磁性材料等新材料的出
现，使固定化酶又成为研究热点，目前酶的固定 化方法已超过200种。
本章主要内容
第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化
第一节 酶的固定化
缺点：① 溶液酶很不稳定 ② 增加分离的难度和费用 ③ 影响产品质量 ④ 回收困难，一次性使用
固定化技术——固定化酶（immobilized enzyme）
有效改善方法之一 思路：设计一种方法，将酶束缚于特殊的相中，
使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分 子交换。 效果：固定化的酶可像一般化学反应中的固体 催化剂一样，既有酶催化特性，又有一般化学 催化剂可回收、反复使用等优点，并可使生产 工艺连续化、自动化。
➢ 优点： ① 操作简单，处理条件温和。 ② 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易 被破坏。 ③ 吸附容量大。
3. 酶的活性中心（active center）
必需基团
活性中心
结合基团 催化基团
活性中心外
专一性 催化性质
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变， 则酶的活性丧失。
活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接相关的部位。
4. 酶的特性
优点：① 催化效率高 ② 专一性强 ③ 反应条件温和 ④ 催化活性受到调节和控制
1969年，千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨 基酰化酶从混合氨基酸中生产L-氨基酸。
1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会 议的主题是固定化酶（immobilized enzyme） 。
我国：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。
固定化酶发展历史
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌 菌体中的天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸。
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß-D-葡萄糖＋O2
D-葡萄糖酸-1, 5-内酯＋H2O2
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
一、固定化酶的制备
早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固定化酶）
1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定义
限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是 指借助物理或化学方法将酶固定于水不溶性载体， 使得酶与整个流体分隔开，但仍能发挥催化效能 的酶制剂形式。
3. 固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）应有最小的空间位阻 （3）酶与载体必须结合牢固，稳定性好 （4）载体不与底物、产物或反应液发生化学反应 （5）成本要低，有利于生产自动化、连续化
4. 酶的固定化方法
酶的固定化
载体结合法 交联法 热处理法 包埋法
凝胶型 微囊型 脂质体 物理吸附 离子结合 共价结合
➢ 优点 ① 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整； ② 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现； ③ 酶失活后载体仍可再生。
➢ 缺点 ① 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不 一定呈平行关系； ② 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活 下降并污染产物。
物理吸附法固定化酶举例
载体
固定化酶
载体结合法
（1）物理吸附法
➢ 原理 ： 通过氢键、疏水作用和π-电子亲和力等物理作用， 将酶固定于水不溶性载体上。
➢ 制备方法: a. 静态法 (static procedure) b. 电沉积法 (electrodeposition procedure) c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反应器装载法 (reactor loading process)
酶工程原理和基本过程
菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→ 酶成品
酶的固定化 原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ←
↓ 反应液→ 产品提取→ 产品
固定化酶发展历史
1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象 （蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。
20世纪50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基 苯乙烯树脂为载体，分别制成固定化的胃蛋白酶、 淀粉酶等。
制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。
.
2 优点
固 定 化 酶 的 特
点 缺点
（1）提高酶稳定性 （2）可反复或连续使用；易于和反应产
物分开；酶的使用效率提高，成本降低 （3）酶反应过程可严格控制 （4）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；
增加产物收率，提高产物质量 （5）较游离酶更适合多酶反应
（1）固定化时酶活有损失 （2）增加了生产初始成本 （3）只能用于可溶底物且较小分子 （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应
活性炭
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶
纤维素
α-淀粉酶、β-淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶
脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
亮氨酸氨肽酶
胰蛋白酶、核糖核酸酶
麸素 硅胶
β-淀粉液化酶 磷酸化酶
酶
(2) 离子结合法
载体 ➢ 原理：酶通过离子键结合于具有离子交换基的
水不溶性载体上。 ➢ 载体：
Hale Waihona Puke Baidu
➢ 常用载体
a. 无机吸附剂： 硅藻土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟 基磷灰石、活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般 很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。
b. 有机吸附剂： 纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量 一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸 酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。
阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤 维素、混合胺类-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE) -纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 阳离子交换剂：如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素 柠檬酸盐、IR-200、Dowex-50等。
➢ 制备方法
在一定pH、温度、离子强度等条件下 ① 将酶液与载体混和搅拌数小时 ② 将酶液缓慢流过处理好的离子交换柱
20世纪70年代后期：固定化细胞技术 1982年，日本首次用固定化原生质体生产谷氨酸 近年来，随着纳米材料和磁性材料等新材料的出
现，使固定化酶又成为研究热点，目前酶的固定 化方法已超过200种。
本章主要内容
第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化
第一节 酶的固定化
缺点：① 溶液酶很不稳定 ② 增加分离的难度和费用 ③ 影响产品质量 ④ 回收困难，一次性使用
固定化技术——固定化酶（immobilized enzyme）
有效改善方法之一 思路：设计一种方法，将酶束缚于特殊的相中，
使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分 子交换。 效果：固定化的酶可像一般化学反应中的固体 催化剂一样，既有酶催化特性，又有一般化学 催化剂可回收、反复使用等优点，并可使生产 工艺连续化、自动化。
➢ 优点： ① 操作简单，处理条件温和。 ② 酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易 被破坏。 ③ 吸附容量大。
3. 酶的活性中心（active center）
必需基团
活性中心
结合基团 催化基团
活性中心外
专一性 催化性质
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变， 则酶的活性丧失。
活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接相关的部位。
4. 酶的特性
优点：① 催化效率高 ② 专一性强 ③ 反应条件温和 ④ 催化活性受到调节和控制
1969年，千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨 基酰化酶从混合氨基酸中生产L-氨基酸。
1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会 议的主题是固定化酶（immobilized enzyme） 。
我国：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。
固定化酶发展历史
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌 菌体中的天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸。