生化药物制造工艺酶类药物(1)

由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，
能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。
（3）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少
酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂
质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。
2.微生物材料的预处理
对于微生物材料提取胞内酶需将菌体细胞破壁，制 成无细胞的悬液后再行提取。 （1） 干燥法：干燥后菌体产生自溶。
金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与催化活性无关 Cu与活性有关，对酶活力是必需的 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的
1.以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD的工艺
【收集】
【洗涤】
新鲜牛血 离心
红细胞
2％NaCl
【溶血】
干净红细胞
H2O,30min
2. 消炎（抗炎）、粘痰溶解酶类 胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、胶原酶、SOD、菠萝 蛋白酶、溶菌酶、玻璃酸酶、DNase
3. 循环酶类 抗凝酶：链激酶、尿激酶、纤溶酶 止血酶：人凝血酶、蛇毒凝血酶、促凝血酶原激酶 血管活性酶：激肽释放酶、弹性蛋白酶
4. 抗肿瘤酶 天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶
5. 其它生理活性酶 青霉素酶、尿酸酶、细胞色素 C
酶类药物
酶的分类
单纯蛋白质（多种氨基酸组成）
酶
酶蛋白（蛋白部分）
结合蛋白质
金属：如Cu2＋、Mn2＋
辅酶或辅基 金属有机物：如铁朴啉 （非蛋白部分） 不含金属的有机物
如：烟酰胺、VB2等的衍生物
胞外酶
酶
游离酶
胞内酶 结合酶
酶类药物：依照其功效和临床应用分类
1. 消化酶类 胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等
Zn，存在于 真核细胞 中
Mn-SOD: 原核细胞中，Mw40000,2个亚基，每个亚基1个Mn
真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基1个Mn
Fe-SOD: Mw38000，2个亚基，每个亚基含1个Fe，存在
于
中
原核细胞
酶的性质
稳定性 对热稳定：天然牛血SOD可75℃加热数分钟，对热 稳定性与溶液离子强度有关 对pH的稳定性：一般pH5.3~9.5较稳定，猪血SOD在 pH7.6～9较稳定
143
35
50
பைடு நூலகம்17.5
调 pH
9.5×105
114
120
40
60
DEAE-C 柱 6.5×105
90
140
32
70
CM-C 柱 3×104
60
200
21
100
既是纯化的结果又是纯化的手段
酶的结晶
☆ 特征：有序性，对称排列，周期性的重复结构 —— 为空间结构研究提供x-衍射样品
1.酶的结晶方法 缓慢改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。 （1）盐析法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）复合结晶法 （4）透析平衡法 （5）等电点法
酶类药物的提取和纯化
原料选择 生物材料的预处理☆
提取
浓缩☆
纯化
结晶☆
材料的预处理
动物材料的预处理：
胞外酶
酶
游离酶
胞内酶 结合酶
（1）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法，
有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其
他处理法。
（2）冻融： 冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。
牛肝【洗涤】
生理盐水
【匀浆】 pH7.8PBS
【离心】上清液【6热5℃变5性m】in
【离心】
上清液
45％、65％（NH4）2SO4饱和度 沉淀【溶解】 溶液【透析】 透析液 【分级 盐析】【离心】
【柱层析】
【超滤】【冻干】
流出液
冻干粉
DE-52
感谢下 载
1） 空气干燥法：适合于热稳定性好的酶。 2） 真空干燥法：适合细菌。 3） 冷冻干燥：适合于较敏感的酶。 （2） 机械法 （3） 酶法处理
酶的浓缩
（1）工业上：超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、 冷冻浓缩
（2）实验室： 除上述方法外，对少量样品可用下列方法 1. 用G-15或G-25浓缩 2. 用聚乙二醇浓缩
【去血红蛋白】
溶血液
上清【分级沉淀】
【溶解】
沉淀液
上清液
乙醇，氯仿，离心
丙酮
H2O，离心
【热变性】 60～70℃，10min，离心
SOD粗提液【浓超缩滤】
【柱层析】
浓缩液
DEAE-SephadexA50
【洗脱】 【超滤】
【冻干】
吸附柱
洗脱浓缩液
pH7.6的2.5～50mmol/L PBS
冻干粉
2.以牛肝为原料提取Mn-SOD的工艺
2.结晶的条件选择
晶种
酶的纯度 酶的浓度
金属离子
温度、时间 pH
酶的分离纯化工作中的注意事项
1. 防止酶蛋白变性
2. 防止复因子丢失
3. 防止酶被蛋白 水解酶降解
超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase, SOD）
结构特点：金属酶
Cu、Zn-SOD: Mw32000，2个亚基，每个亚基含1个Cu，1个
酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化
注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法 2.建立活力回收表
从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表
步骤
总蛋白 总活力单位 比活力 回收率 纯化倍数
（mg） （×106） （u/mg） （％）
匀浆
1.43×108
286
2
100
1
乙醇粗沉淀 4.1×106