人胰岛素的制备 生物技术制药

优化发酵条件
采用比浊法测定不同时间培养基中菌量， 绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培 养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌，培养4小时候即 进入对数生长期，而且对数生长期可延长至17小时。 1，正交优化实验： 采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优 化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速(通风量)，IPTG诱导 温度，接种量，IPTG添加量，诱导时间，补料方式。分别用A、B、 C、D、E、F、G表示．以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的 A600为目标量，考察条件优化的效果，进行八次实验，对实验结果进 行分析，优化出最佳实验条件。 2，其他条件优化： 在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重 组蛋白诱导的影响作了分析。 3，放大培养（比较不同发酵工艺产量）： 在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至1 L培养基中比较两种 发酵工艺。在不同转速，通气量，pH条件下，比较选择产量最高的 发酵工艺。
（二）mRNA转录合成cDNA第一链
cDNA 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNasefree water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反 应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检 验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置 于冰上。电泳分析，同位素活性测定。
(一)重组人胰岛素的大肠杆பைடு நூலகம்工程菌的构建
A链和B链同时表达法
重组DNA的转化
1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞： 取100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷 的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 ，冰浴放置12 - 24小时，备用。 2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组，DNA连接液 ，混匀。冰浴放置半小时 。在42 ℃保温 2 分钟（热脉冲），快速 将转化细胞转移至冰浴中放置1 – 2 分钟 。加入1 ml 新鲜培养基 ，于37 ℃培养 1 小时（扩增） 。涂在合适的固体培养基平板上进 行筛选。

采用pBR322作为载体，用双酶切法进行基因重组。
一 、 pBR322简介 F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。 其作为载体的优点为： ①双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。 外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
经典的CaCl2转化方法
(二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）
抗药性筛选法： 抗药性筛选法的基本原理： 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板，再将Ap 平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平 板上，在Ap平板上生长，但在Ap和Tc平 板上不长的转化子即为重组子。 再经l％琼脂糖凝胶电泳，限制性图普， PCR检测．DNA测序以及SDS-PAGE等分 析，检测并证实了整个重组体的构建和表达 筛选过程
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 ③ 高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy ④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization), 不能通过接合转移。 １.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基 因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端 可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程 pBR322用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。 外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体 外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外 源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位 点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基 互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。
反转录-聚合酶链反应法
(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA
1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后 用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电 泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。 将 Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心， 加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链
通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰 岛素的cDNA链 ,获得目的基因（通过凝胶电泳回收测序后方 可使用）。
PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸


前端引物： 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ 后端引物： 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’