载体构建

载体构建分为以下步骤：
1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因
2.目标片段的PCR扩增
3.载体和目标片段的限制性酶切
4.连接转化
5.挑取克隆提质粒
6.单克隆的验证及送样测序。

载体的选择
实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。

根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。

举例如下：
实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。

应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。

引物设计
引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。

在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。

载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。

常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。

Flag标签：
D Y K D D D D K
GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG
6XHis标签：
H H H H H H
CAC CAC CAC CAC CAC CAC
HA标签：
Y P Y D V P D Y A
TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT
Myc标签：
E Q K L I S E E D L
这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。

因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。

翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。

对于真核表达载体，蛋白在真核生物中表达时切记应加入kozak序列，kozak序列是核糖体在识别mRNA上起始位点时的必须元件，蛋白在翻译表达时时从kozak序列后的第一个ATG 开始翻译。

并且，kozak序列的存在可以使蛋白的翻译表达效率提高很多倍。

根据以上原则，仍然以MYC为例：
1.在NCBI中查找MYC的CDS序列。

2.将序列复制粘贴至DNAMAN中分析：
在这些不含有的酶切位点中选择与载体对应的酶切位点，本次举例选择pCDNA3.1
所选择的酶切位点为KpnI和XhoI.
引物设计如下：酶切位点Flag标签
MYC-PCD-KpnI-Flag-F:GG GGTACC GCCACC ATG GATTACAAGGATGACGACGATAAG
保护碱基 kozak atg
GATTTTTTTCGGGTAGTGGA
MYC上游引物
酶切位点 MYC下游引物
MYC-PCD-XhoI--R:CC CTCGAG ATT CGCACAAGAGTTCCGTAGCT
保护碱基终止子
目标片段的PCR扩增和回收
因为后续将目的片段插入之后做的是表达，所以不能引入突变，我们实验室用的是Q5高保真酶，PCR扩增体系如下：
Q5 reaction Buffer 10ul
Q5 GC enhancer 10ul
模板gDNA(50ng)/cDNA(25ng)/质粒(0.1-1ng)/PCR产物(0.01-0.1ng)
dNTP(10mM) 1ul
F（10uM）1ul
R（10uM）1ul
Q5 0.5ul
ddH2O to 50ul
PCR扩增时是呈指数增长，即使只有少量模板，也能得到大量的目标片段，反之若模板含量过多，则会是的引物与模板非特异结合，扩增出非特异片段。

引物也不宜加多，引物过量会使得引物自身之间相互结合，扩增之后产生过多的引物二聚体。

获得PCR产物之后，产物里有酶，dNTP,引物二聚体和目标片段，所以需要切胶回收获得较纯的目标片段。

切胶回收组内有相应的试剂盒，流程如下：
（1）紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul），切碎凝胶，装入2mL PCR管中。

（2）加入3倍体积的Buffer A溶液，75℃水浴锅加热直至凝胶完全融化。

（3）加入1/2Buffer A体积的Buffer B ，观察溶液颜色由红变黄，并无明显颗粒，表示凝胶
融化完全。

（4）吸取上述步骤中的溶液并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000×g离心1 min，弃滤液。

（5）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min，弃滤液
（6）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。

弃滤液。

* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

（7）将制备管置回2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。

（8）将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加25~40μl Eluent，室温静置1 min。

12,000×g离心1 min。

载体质粒的扩繁
转化
（1）取2μl 质粒加到1.5mLEP管中，并放置于冰上。

（2）取30μl 大肠杆菌DH5α感受态细胞加入质粒中，冰上放置30min。

（3）将水浴锅调至42℃，将上述混合液放在水浴锅中热激1min30s。

（4）取出热激后的混合液，冰上放置2min，加300ul SOC培养基。

（5）再放置37℃，190rpm摇床上培养1小时
（6）取50ul涂布相应抗性的LB固体培养基，放在37℃温箱中过夜培养。

质粒提取
（1）挑取培养基上的单菌落于含有10ml液体LB培养基的50ml培养瓶中37℃过夜培养（2）取1-4 ml上述过夜的菌液12,000×g 离心1 min，弃尽上清。

（2）加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

* 确认Buffer S1中已加入RNase A。

（3）加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

此步骤不宜超过5 min。

* Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer 的NaOH，降低溶菌效率。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。

* 此步骤不宜超过5 min。

（4）加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10 min。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。

（5）吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000×g离心1 min，弃滤液。

（6）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min，弃滤液。

（7）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。

弃滤液。

（8）将制备管置回2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。

（9）将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μl Eluent，室温静置1 min。

12,000×g心1 min。

（10）取1μl （9）中溶液进行凝胶电泳检测。

载体和目标片段的限制性酶切
酶切时注意以下原则：
1.buffer的体积应大于等于酶的体积；
2.酶量宜少不宜多，酶反应时间可适当延长；
3.酶切时间不能太长，否则会乱切；
4.酶切体积不应过小，否则会影响酶切效率；
5.添加酶时可按照1ul切1ug质量来计算。

酶切体系如下（举例）：
10Xbuffer 3ul
酶1 1ul
酶2 1ul
目的片段/载体1ug
ddH2O to 30ul
37℃酶切3-4h即可。

酶切产物应进行回收才可继续后续的连接转化工作，回收的步骤同PCR产物回收。

注：上述讲述的均为双酶切，有时候我们需要使用单酶切来做载体和片段的连接，这时载体容易自身连接形成假阳性菌斑，所以在载体酶切后对载体进行脱磷，之后在进行切胶回收。

脱磷时只需在酶切体系中加入10Xbuffer和0.5ul的去磷酸酶，37℃过夜。

核苷酸中的磷酸基团在合成核酸时，磷酸基团位于5’端。

在连接时，脱磷后的载体自身连接效率极低，因为两端都没有磷酸基团，不会形成一端连接的缺克，多呈线性，所以连接出来的斑基本都是目标片段和载体的阳性克隆。

但应该在做连接时，做一个载体自连的阴性对照。

阴性对照应基本不长斑，而目标片段和载体的连接产物长出的斑应远远大于阴性对照，结果才可靠。

连接转化
连接体系如下：
10Xbuffer 1ul
T4连接酶1ul
载体0.01pmol
目的片段0.1pmol
水to 10ul
连接条件可以使25℃2h，也可以16℃过夜（12-16h）
转化同上。

挑取克隆提质粒
平板长出的斑不免存在假阳性，所以在挑菌时应该多挑单克隆，提质粒后进行酶切验证，送阳性克隆测序。

挑菌在超净工作台进行，应严格无菌操作，在使用前将所需器材放进超净工作台（除平板）紫外照射20min后方可操作。

质粒抽提步骤同上。

单克隆的验证及送样测序
挑取阳性克隆提质粒后，应进行验证，对于双酶切连接，采取的是双酶切验证，在验证时体系同酶切连接时类似，但酶量应减少，每个反应体系加0.1ul酶，质粒加入100-200ng即可。

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆会出现两条带，一条是与载体大小相同，一条与目的片段大小相同。

在验证时应做阴性对照，即对载体进行相应的双酶切，其酶切产物只有一条带。

对于单酶切的连接，因为是同样的酶切位点，所以在连接时，可能是ATG在前，也有可能是TAA在前，而我们需要的是ATG在前。

应采用PCR的方法验证，在载体上设计一段引物F，与目标片段的R引物一起扩增，只有插入顺序正确的质粒才能扩增出目的片段，错误的无法扩增。

将验证后确定正确的阳性克隆质粒送样测序。