《生物化学实验技术》PPT课件
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《生物化学大实验》课件
了解酶催化反应的原理和酶的结构和功能，以及 如何通过酶的特定测量鉴定酶活性。
分子生物学基本概念
深入探究DNA和RNA的功能及其在遗传学中的 应用，以及基因转录和翻译的分子机制。
蛋白质的结构和功能
探究蛋白质的三级结构，以及它们在细胞代谢过 程中所扮演的角色和功能。
样本制备
1
样本收集
收集到分离它们所需要细胞结构。
2 个人在实验中的收获
分享个人在实验中收获的方面，包括技能和知识的提高以及更广泛的收获。
3 对未来实验的展望
展望未来实验中可能遇到的挑战，提供有效的解决方案。
生物化学大实验
欢迎来到《生物化学大实验》PPT课件。本课程将介绍生物化学和分子生物 学的概念，酶的作用及机制，以及蛋白质的结构和功能。我们还将深入了解 实验过程并分享实验的结果和分析。
知识点介绍
生物化学基本概念
了解生物大分子，如蛋白质、核酸等的组成和结 构，以及它们在生命活动过程中的作用。
酶的作用及机制
细胞破碎液制备
2
将细胞破碎并加入含有缓冲液的溶液中。
3
离心和裂解
使用高速离心机离心裂。
利用生物化学技术从混合物中纯化蛋白 质。
蛋白质检测
Lowry方法
利用此化学方法可测定样品中蛋 白的含量。
Bradford方法
此方法是结合了蛋白质与染料结 合的测量方法。
BCA法
BCA法是利用氢氧化物还原双烷 基四氯化钴为蓝色络合物，来测 定蛋白质的含量。
酶活性测定
酶促反应原理
明白酶对催化反应的影响以及如何准确测定酶的含量。
酶活性的测定方法
学习测量酶活性的几种标准方法，并了解如何选择最佳方法。
酶的特定测量
分子生物学基本概念
深入探究DNA和RNA的功能及其在遗传学中的 应用，以及基因转录和翻译的分子机制。
蛋白质的结构和功能
探究蛋白质的三级结构，以及它们在细胞代谢过 程中所扮演的角色和功能。
样本制备
1
样本收集
收集到分离它们所需要细胞结构。
2 个人在实验中的收获
分享个人在实验中收获的方面，包括技能和知识的提高以及更广泛的收获。
3 对未来实验的展望
展望未来实验中可能遇到的挑战，提供有效的解决方案。
生物化学大实验
欢迎来到《生物化学大实验》PPT课件。本课程将介绍生物化学和分子生物 学的概念，酶的作用及机制，以及蛋白质的结构和功能。我们还将深入了解 实验过程并分享实验的结果和分析。
知识点介绍
生物化学基本概念
了解生物大分子，如蛋白质、核酸等的组成和结 构，以及它们在生命活动过程中的作用。
酶的作用及机制
细胞破碎液制备
2
将细胞破碎并加入含有缓冲液的溶液中。
3
离心和裂解
使用高速离心机离心裂。
利用生物化学技术从混合物中纯化蛋白 质。
蛋白质检测
Lowry方法
利用此化学方法可测定样品中蛋 白的含量。
Bradford方法
此方法是结合了蛋白质与染料结 合的测量方法。
BCA法
BCA法是利用氢氧化物还原双烷 基四氯化钴为蓝色络合物，来测 定蛋白质的含量。
酶活性测定
酶促反应原理
明白酶对催化反应的影响以及如何准确测定酶的含量。
酶活性的测定方法
学习测量酶活性的几种标准方法，并了解如何选择最佳方法。
酶的特定测量
《生物化学实验》教学课件—22 核酸的定量测定-定糖法
生物化学实验技术
核酸的定量测定—— 定糖法（地衣酚法）
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地 衣酚法）的原理和操作技术
生物化学实验技术
二、实验原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解， 形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二羟 基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用 三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在 670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200 μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度成正比关 系。
生物化学实验技术
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核 糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各 不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种 RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来 源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从 曲线求得被测样品的RNA含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：试管及管架 、水浴锅 、移液管、 可见光分光光度计。 2、试剂：RNA标准溶液，RNA样品溶液， 0.1%地衣酚试剂。
时的取样毫升数，求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。 按下式计算样品中核酸的质量分数：
CV × 11 W = m × 100%
W：核酸的质量分数（％）； C：有机磷的质量浓度（μg/mL）； V：样品总体积（mL）； 11：因核酸中含磷量为9％左右，1μg磷相当于11μg核酸； M：样品质量（μg）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
×
100%
生物化学实验技术
3、无机磷的测定 吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于
100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取 3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水 浴中保温10min，测A660nm。
核酸的定量测定—— 定糖法（地衣酚法）
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地 衣酚法）的原理和操作技术
生物化学实验技术
二、实验原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解， 形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二羟 基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用 三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在 670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200 μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度成正比关 系。
生物化学实验技术
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核 糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各 不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种 RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来 源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从 曲线求得被测样品的RNA含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：试管及管架 、水浴锅 、移液管、 可见光分光光度计。 2、试剂：RNA标准溶液，RNA样品溶液， 0.1%地衣酚试剂。
时的取样毫升数，求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。 按下式计算样品中核酸的质量分数：
CV × 11 W = m × 100%
W：核酸的质量分数（％）； C：有机磷的质量浓度（μg/mL）； V：样品总体积（mL）； 11：因核酸中含磷量为9％左右，1μg磷相当于11μg核酸； M：样品质量（μg）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
×
100%
生物化学实验技术
3、无机磷的测定 吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于
100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取 3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水 浴中保温10min，测A660nm。
《生物化学实验指导》课件
实验操作问题
实验设备使用不当，导致设备损 坏或实验失败。
解决方法
加强实验材料管理，确保学生正 确使用和管理实验材料。
实验操作问题
实验材料管理不善，导致实验结 果受影响。
解决方法
提供设备使用说明和注意事项， 确保学生正确使用设备。
实验结果异常分析与处理
异常分析
01 实验结果与预期不符，可能存
在误差或错误。
01
02
03
实验技术原理
介绍实验所涉及的基本原 理，包括生物学、化学和 物理学原理等。
实验步骤
详细描述实验的操作流程 ，包括实验前的准备、实 验操作步骤、实验后处理 等。
注意事项
提醒实验中需要注意的事 项，以确保实验的准确性 和安全性。
实验数据分析与处理
数据收集
说明如何收集实验数据， 包括仪器的使用和数据的 记录等。
按照指导老师的安排进行实验 操作，不得擅自更改实验步骤
或使用未经批准的试剂
爱护实验室设备和器材，保持 实验室卫生整洁
02
生物化学实验基本操作
实验器材介绍与使用
实验器材
介绍生物化学实验中常用的实验 器材，如烧杯、量筒、滴管、离 心管等，并说明其用途和特点。
使用方法
详细介绍各种实验器材的使用方 法和注意事项，确保学生正确使 用，避免因操作不当造成实验误 差或安全事故。
04
生物化学实验案例分析
案例一：DNA提取与鉴定
总结词
基础实验，了解DNA提取与鉴定的基本原理和操作步骤。
详细描述
本案例介绍了DNA提取与鉴定的基本原理、实验材料、操作步骤、注意事项和 实验结果分析，旨在让学生了解DNA提取与鉴定的基本过程，掌握相关的实验 技能。
生物化学检验ppt课件
酶类CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
生物化学实验课件
第十五页，共128页。
(二) 还原作用 许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在 的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、 银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖 酸及其他产物。糖类这种性质常被利用 (lìyòng)于检测糖的还原性及还原糖的定量 测定。 本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克 特试剂。它们都是Cu2＋的碱性溶液，能使还 原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄 色（颗粒小）的Cu2O沉淀。 本尼迪克特试剂是改良的斐林试剂。（见 P100,101脚注）
第二十五页，共128页。
一、实验目的
1、学习和掌握(zhǎngwò)测定脂肪碘值
的原理和方法。
教材(jiàocái)第6、7页
2、了解和学习空白对照实验的原理和方
法
第二十六页，共128页。
二、实验原理(yuánlǐ) 碘值（价）是指100g脂肪在一定 条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂 肪的一个重要常数，可用以判断脂肪 所含脂肪酸的不饱和程度。 脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱 和脂肪酸具有一个或多个双键，能与 卤素起加成作用而吸收卤素。
第三十二页，共128页。
附注 （1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应 不完全。 （2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试 剂不够(bùgòu)，必须再添加10～15 mL试剂。 （3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶 解不完全，可再加些CCl4。（4）将近滴定终点时，用力振荡 是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡 不够(bùgòu)，CCl4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使 碘进入水层。 （5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。
第三十三页，共128页。
五、实验结果记录(jìlù) 1、原始数据记录(jìlù) 1）花生油的质量 W值 2）Na2S2O3摩尔浓度 C值
(二) 还原作用 许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在 的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、 银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖 酸及其他产物。糖类这种性质常被利用 (lìyòng)于检测糖的还原性及还原糖的定量 测定。 本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克 特试剂。它们都是Cu2＋的碱性溶液，能使还 原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄 色（颗粒小）的Cu2O沉淀。 本尼迪克特试剂是改良的斐林试剂。（见 P100,101脚注）
第二十五页，共128页。
一、实验目的
1、学习和掌握(zhǎngwò)测定脂肪碘值
的原理和方法。
教材(jiàocái)第6、7页
2、了解和学习空白对照实验的原理和方
法
第二十六页，共128页。
二、实验原理(yuánlǐ) 碘值（价）是指100g脂肪在一定 条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂 肪的一个重要常数，可用以判断脂肪 所含脂肪酸的不饱和程度。 脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱 和脂肪酸具有一个或多个双键，能与 卤素起加成作用而吸收卤素。
第三十二页，共128页。
附注 （1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应 不完全。 （2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试 剂不够(bùgòu)，必须再添加10～15 mL试剂。 （3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶 解不完全，可再加些CCl4。（4）将近滴定终点时，用力振荡 是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡 不够(bùgòu)，CCl4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使 碘进入水层。 （5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。
第三十三页，共128页。
五、实验结果记录(jìlù) 1、原始数据记录(jìlù) 1）花生油的质量 W值 2）Na2S2O3摩尔浓度 C值
生物化学实验课件
通过转氨基作用形成的氨基酸可通过展层层析检测。氨基酸的纸层析属 于分配层析，滤纸为支持介质，滤纸上所吸附的水为固定相，有机溶剂
为流动相。把混合氨基酸样品点于滤纸上，使流动相经样品点移动，混 合氨基酸在两相溶剂间进行分配，在固定相中分配比例较大的氨基酸， 随流动相移动的速度慢；在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相 移动的速度快。由于各种氨基酸的分配系数不同，在一定时间内，逐渐 集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后显色，使氨基酸显 色形成斑点。
18
3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤
具体参见实验指导书
19
5. 结果处理
根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得 相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白 (g质 /鲜 g含 )重 查 样 量得 品(的 鲜 g)测 蛋 重( 定 白 g )提 时 质取 取 含液 用 量((m 总 提 m )ll体 取 ) 积 液
6. 注意事项
比色应在出现蓝色后2min~1h内完成。
20
7. 思考题
1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的 原理是什么？
2）如何正确使用分光光度计？
3）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理 有哪些不同？
21
酶的基本性质
1.目的 酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，
生物体内的化学反应基本上都是在酶催化下 进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、 特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对 酶力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其 调控机理具有十分重要的意义。
5
2.1氨基酸的两性解离和等电点
2.1.1 氨基酸的两性解离
H 3 N + C RC HO K 1H O ' 3 N + C R H C H-O K 2H ' 2 O N C RC H-O
生物化学实验设计PPT课件(初中科学)
。
实战演练：
（09杭州）某同学将生长状况类似的A、B二盆蚕豆幼苗分别置于
两个暗箱中，在B盆蚕豆幼苗的暗箱右侧开一小窗口，并在窗口外
侧装一个固定光源，保持其它环境条件适宜并相同。一星期后，
A,B两盆蚕豆幼苗的生长状况如图所示。请回答下列问题：
(1)该同学设计这一实验的目的是为了探究
单侧光对蚕豆幼苗生长的影响
（3）每组为什么要选用较多数量的胚 减少由于种子死亡 ？
或遗传差异带来的误差
实战演练：
(4）小芳同学认为叶绿素的合成除了需要镁等矿物质 元素外，还需要其他的一些环境条件。她设计了如下 表的方案。
分析小芳同学的实验设计，你认为她要研究的问题
是 叶绿素的合成是否需要光
。
根据实验设计方案提出研究问题的技能是:
。
化学实验设计和评价
❖ 化学实验设计题和实验评价题是对学生进行实验综合能力考 查的题型之一，是当前课程改革和中考所关注的热点。其命 题方式通常有：①设计反应原理 ②设计实验装置 ③设计操 作程序 ④侧重于某一要求的综合设计并含定量设计要求⑥以 批评的思想方法对所提供的实验方案进行评价。
❖ 解答实验设计题时，必须遵循“四性”：科学性、可行性、 规律性、创新性。即原理正确、操作简便、现象明显、药品 经济、结论可信、有创新意识。解答实验评价题时，要环绕 题目提供的多种方案，从原理是否科学合理、操作是否简单 可行、所用试剂是否经济、实验现象是否明显、是否体现 “绿色化学”等方面进行评价。
不同浓度的重金属污染液中的种子萌发率都比
蒸馏水中的低，幼苗根长也较短。随着重金属浓度 的升高，种子萌发率降低，幼苗根长也缩短。
活动二：
设计一份实验记录单
培养皿
污染液 浓度 萌发率
《生物化学实验》教学课件—29 大蒜细胞SOD的提取与分离
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液， 光照一定时间后测定波长下各液光密度值，抑 制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范 围内呈正比。
以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光 还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出 二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相 对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光 还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活 力单位（U）。
生物化学实验技术
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负 离子，当加入NBT后，在光照条件下，与超 氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还 原生成蓝色的二甲月替。当加入SOD时，可 以使超氧自由基与H+结合生成H2O2 和O2，从 而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月 替生成速度减慢。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、实验材料：新鲜蒜瓣 2、仪器：恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可 见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒。 3、试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）， 氯仿-乙醇混合液，丙酮，0.05mol/L碳酸盐缓 冲液（pH10.2），0.1mol/LEDTA溶液， 2mmol/L肾上腺素溶液。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化 50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：
酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾 上腺素自氧化50%的换算系数。
生物化学实验技术
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙 醇混合液搅拌15min，5000 rpm离心15min， 得到的上清液为粗酶液。 4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的 冷丙酮，搅拌15min，5000 rpm离心15min， 得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸 缓冲液（pH7.8）中，于55~60℃热处理15min， 得到SOD酶液。
《生物化学》全套PPT课件
研究对象
生物大分子（蛋白质、核酸、多糖等 ）及其相互作用；生物小分子（氨基 酸、脂肪酸、糖类等）及其代谢；生 物体内能量转化与传递等。
2024/1/26
4
生物化学发展历史及现状
发展历史
从19世纪末到20世纪初，生物化学逐渐从生理学和有机化学中独立出来，成为 一门独立的学科。随着科学技术的不断发展，生物化学的研究领域和深度不断 拓展。
胆固醇的生理功能
胆固醇在体内具有多种生理功能，如参与胆汁酸的合成、 构成细胞膜、合成类固醇激素和维生素D等。
胆固醇代谢异常与疾病
胆固醇代谢异常可导致多种疾病的发生，如高胆固醇血症 、动脉粥样硬化等。因此，维持胆固醇代谢平衡对于预防 和治疗相关疾病具有重要意义。
26
06 基因表达调控与疾病关系
2024/1/26
入三羧酸循环彻底氧化分解，释放大量能量。
2024/1/26
03
甘油代谢途径
甘油在体内可转化为磷酸二羟丙酮，进而进入糖酵解途径分解产生能量
，或转化为葡萄糖等供能物质。
24
磷脂代谢途径探讨
磷脂的合成与分解
磷脂合成主要发生在肝脏和肠黏膜细胞中，以甘油二酯为骨架，通过CDP-甘油二酯途径 合成不同种类的磷脂。磷脂的分解则通过磷脂酶的作用，水解生成甘油、脂肪酸和磷酸等 产物。
2024/1/26
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残 基的相对空间位置，包括 结构域、超二级结构等。
四级结构
由多个具有独立三级结构 的亚基组成的复杂空间结 构。
10
蛋白质功能多样性
催化功能
作为酶催化生物体内的化学反应。
运输功能
如载体蛋白，血红蛋白运输氧气等。
营养功能
《生物化学实验》教学课件—35 血液中转氨酶活力的测定
生物化学实验技术
生物化学实验技术
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合， 生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光 谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长 比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较 丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转 氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加， 因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应 体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本上呈 线性关系，故可藉以测定谷丙转氨酶的活力。
3、酮体的测定
（1）另取2只50mL锥形瓶，按下表编号后加 入有关试剂。加完试剂后摇匀，放置10min。
编号
滤液1
I（实验） 2.0 II（对照） --
试剂（mL）
滤液2
0.1mol/L 10%NaO
H2O
碘溶液 H溶液
--
--
3.0
3.0
2.0
--
3.0
3.0
生物化学实验技术
在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算每 100mL血清中转氨酶的活力单位数。
混匀后，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液/mL
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀后，室温放置10min，以0号管作空白，在505nm比色
丙酮酸的μmol数（横坐标） 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A505nm（纵坐标）
生物化学实验技术
2、另取2支试管，按下表进行操作。
生物化学实验技术
本实验以丙氨酸及α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶 （GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛 作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮 酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼 结合，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液 中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于 测定丙酮酸含量。
生物化学实验技术
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合， 生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光 谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长 比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较 丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转 氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加， 因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应 体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本上呈 线性关系，故可藉以测定谷丙转氨酶的活力。
3、酮体的测定
（1）另取2只50mL锥形瓶，按下表编号后加 入有关试剂。加完试剂后摇匀，放置10min。
编号
滤液1
I（实验） 2.0 II（对照） --
试剂（mL）
滤液2
0.1mol/L 10%NaO
H2O
碘溶液 H溶液
--
--
3.0
3.0
2.0
--
3.0
3.0
生物化学实验技术
在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算每 100mL血清中转氨酶的活力单位数。
混匀后，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液/mL
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀后，室温放置10min，以0号管作空白，在505nm比色
丙酮酸的μmol数（横坐标） 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A505nm（纵坐标）
生物化学实验技术
2、另取2支试管，按下表进行操作。
生物化学实验技术
本实验以丙氨酸及α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶 （GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛 作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮 酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼 结合，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液 中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于 测定丙酮酸含量。
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【仪器试剂】
电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素 薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗 掖。
【实验原理 】
1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH 环境下，混合蛋白质中各种成分带电量 不同、分子大小不同，在同一电场中泳 动的速度不同，导致相同的时间迁移的 距离不同而把它们分开。
（1）分子越小，泳动速度越快
（2）带电量越多，泳动速度越快 反之，越慢。
实验五
胰岛素和肾上腺素对血糖 含量的影响
—Folin-Wu法
【实验目的】
1.掌握影响血糖含量的因素； 2.熟悉测定血糖的原理和方法及临床
意义； 3.熟悉动物取血的基本操作。
【仪器试剂】
722型可见光分光光度计、血糖管、 奥氏吸管、锥形瓶、注射器等；钨酸 钠、浓硫酸、磷钼酸、碱性铜等。
用于吸抗凝血,中间为膨大 的球体,减少血液和吸管壁 的接触面积,尽量避免融血.
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
钼蓝 通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！
【实验操作】
1．动物准备 取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重
（一般为2～3kg）。 2．取血
以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺 破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1 的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml） 边摇匀，以防凝固。 用干棉球压迫血管止血。
【注意事项】
• 1．本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。 • 2．各种试剂的加入量要准确。 • 3．严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其
产物量的准确度
【思考题】
• 1．为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？ • 2．酶促反应的影响因素有哪些？ • 3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？
3．注射激素后取血
(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛 素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时 间。一小时后再取血。取血后立即腹腔或皮下 注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性 休克而死亡。 (2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按 0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时 后再取血。
• 2．计算各管[S]。 [S]＝加入[S]量/3.0×0.02
• 3．进一步计算出各管1/V和1/[S]。 • 4．将上述数据填入下表
数值 1号 2号 3号 4号 5号 6号
光密 度值 V 1/V [S] 1/[S]
以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其 连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该 酶的Km。
实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
【实验原理 】
1.体内血糖水平主要依靠激素的调节
主要调节 激素
降低血糖：胰岛素
升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、 糖皮质激素、肾上腺素
胰岛素(insulin)： 体内唯一降低血糖水平的激素
肾上腺素：主要在应激状态下发挥调节作用。
本实验采用吴宪氏法测定血糖， 要求将血液制成无蛋白血滤液：???
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。
【思考题】
1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果 有什么影响？
2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？
（二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳
【实验目的】
1. 掌握电泳的基本原理； 2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和
应用。
（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素
①电荷(同种电荷相斥）
++
②水化膜（隔离） + Pr +
++
中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋 白质沉淀。
+ +
+ Pr +
++
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的 水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入 蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋 白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0
• 2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作
管号 1
2
3
4
5
6
蛋白标准 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
液（ml）
生理盐水
（ml） 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
• 混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光 径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光 度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白 质的浓度为横坐标绘制标准曲线。
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
【实验结果】
可用＋、－号表示有无呈色或颜色深 浅。将双色脲反应呈色最深的一管收 集液保留供下次实验使用。利用醋酸 纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ球蛋白的纯度。
【实验注意事项】
1． 使用离心机前注意配平； 2． 装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面
要平整； 3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间； 4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
2.无蛋白血滤液的制备原理
COOH
2R
+ H2WO4
NH2
COOH
R
WO4
NH2 2
此方法是生物碱沉淀蛋白质
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
3.利用吴宪氏法测定血糖的原理
G + Cu2+ Cu2O +3H3PO4.2MO3.12H2O
6CuO +
3H3PO4.2MO2O3.12H2O
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。
【实验结果】
根据电泳区带出现的位置和条数判 断是何种血清蛋白，如果只是一条 γ-蛋白说明上个实验分离纯化的较 好。
【实验注意事项】
1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛
面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定