并用连接酶把目的基因连接到载体上

First transgenic plant
First Bt corn plants
Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized
‘83 ‘84 ‘85 ‘86 ‘87 ‘88 ‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 ‘01 ‘02

与常规育种技术相比，转基因育种具 有很大优势：
a. 可以利用的基因资源大大拓宽。 b. 为培育优良品种提供了崭新的育种途径。 c. 可以对植物的目标性状进行定向变异和定 向选择。 d. 可以大大提高选择效率，加速育种进程。
第一节 作物的转基因技术
A Little Bit of History……
3、按插入基因的遗传性状进行筛选 插入基因 （外源基因表达产物鉴定法） • 抗体检测（Western Blot) • 蛋白质生物功能检测法 • 蛋白凝胶电泳检测法
六、目的基因的确认分析—— DNA序列测定
1、Maxam-Gilbert化学降解法 测定pBR322 4362 bp的序列， 但 Tedious and Labor-intensive
（1）原理： 根据核酸的碱基互补配对原则，核酸标记的特异 DNA 或RNA探针只能与特异的基因杂交，用一定的方法将细菌 的DNA或RNA固定在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，在 适合的条件（如离子强度、温度）下用特异标记核酸探针 与之杂交，标记探针就与特异基因牢固结合，将非特异结 合探针洗去后，经放射自显影后，就可指示有特异 DNA片 段重组子的位置。
（2）电击法转化（electroporation） 1）原理： 2）特点 a．操作简单，不需制备感受态细胞。 b．转化率极高109～1010转化子／ugDNA c．任何菌株均适用 3）应用：可用于文库的构建及其它要求极高的 转化。
2、转染（transfection）
指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导人细胞的 过程。 （1）原理： （2）特点 1）转染效率高107 pfu／ug DNA; 2）外源DNA可整合入宿主细胞染色体中处溶 源状态; 3）虽不需制备感受态细胞和热休克处理，但 其转染效率常受多种因素影响，且克隆的保 存也较复杂。 （3）应用：常用于文库的构建
转Bt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现
二、转基因育种的程序
作物 大豆 玉米 烟草 棉花 油菜 合计 1996年 50 30 100 80 12 280 1997年 510 320 160 140 120 1250 1997年/1996 年 10.2 10.7 1.6 1.8 10 4.5
全球转基因作物种植面积比较 （单位：万公顷）
（二）我国转基因作物研究与利用概况
第十六章 转基因技术
与作物育种 Chapter 16 Transgenic Technology and Crop Breeding

作物转基因育种：根据育种目标， 从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进 入受体作物，经过筛选获得稳定 表达的遗传工程体，再经过田间 试验与大田选择育成转基因新品 种或种质资源。
2、根据重组子的结构特征筛选
1）快速裂解菌落鉴定分子大小 重组子的分子量较大（适用于插入片段较 大的重组子） 2）内切酶图谱鉴定 重组子与非重组子的内切酶图谱不同 3）PCR筛选重组子 利用插入片段两端的特异引物，进行PCR， 能扩增出特异片段的转化子为重组子。
4）核酸分子杂交（菌落、噬菌体原位杂交法）
基因克隆（gene cloning）： 利用无性繁殖的方法获得大量核苷酸copy， 又称分子克隆（molecular cloning) 。 基因工程（gene engineering)： 是在用重组DNA技术获得的杂合DNA分 子的基础上，将该杂合分子在一定的宿主 细胞中扩增，形成大量与亲本完全相同的 子代分子的过程。
First field tests
Rotting resistant tomato approved by FDA
Delay-ripening tomato Commercialized in the US
GM maize approved by EU
一、转基因技术的发展现状
（一）国际转基因植物研究与现状
Transgenic plants were first created in 1983s. These early transgenic plants were resistant to antibiotics and cancer drug, demonstrating the potential of transgenic plants. Subsequent research has developed transgenic plants with commercially useful traits such as resistance to herbicides, insects, and viruses.
1．按载体的性状进行筛选
1）抗性转入获得（多用于筛选转化子） 2）抗性插入失活 指外源DNA片段插入载体的抗性基因中，致该基 因无法正常表达有活性的抗性蛋白。
3）蓝白斑筛选（一互补） 载体：LacZ的调控序列和N端146个氨基酸残 基的编码序列（受体） 宿主菌：染色体DNA含有LacZ的C 端编码序列 （供体） 一互补 分解生色底物X-ga1（5-溴-4-氯-3吲哚--D-半乳糖苷）产生蓝色外源DNA片段插入 质粒的多克隆位点白色克隆。
二、外源 DNA 片段和载体的限制 性 内 切 酶 切 割 ( 接 ）
三种切割方式： 5’粘端： 5’-G 3’ 粘端： 5’-CTCGA 3’ -G AATTC-3’ G-3’
3’ -CTTAA G-5’ AGCTC-5’
平末端： 5’-CCC GGG-3’ 3’ -GGG CCC-5’
四、重组DNA转入宿主细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ (转）