嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定

嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定

嗜酸氧化硫硫杆菌[78]（Acidithiobacillus thiooxidans At.t）是一类硫氧化细菌的总称，它们在形态学和生理学上存在着多样性，而且可能是不同种类的细菌[79]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans, At.f）和嗜酸氧化硫硫杆菌是目前在生物冶金方面研究最多、最重要的两种菌。氧化亚铁硫杆菌利用铁源浸矿时会在矿物表面形成硫层，阻碍进一步浸矿，而嗜酸氧化硫硫杆菌却可以利用硫，将阻碍浸矿的硫层除去[80]，因而它在浸矿中的作用尤为重要。

本文从土壤样品中分离纯化出了一株硫氧化细菌，对其进行了形态学、生理生化特征和16S rDNA鉴定和分析，为后面探讨其浸矿机理奠定基础。鉴定结果表明此菌属于嗜酸氧化硫硫杆菌，命名为HY-01。

2.1 试剂与材料

2.1.1 菌种来源

实验所用菌株为本实验室从湖北大冶铜山口酸性土壤中分离所得；大肠杆菌为本实验室保存菌种。

2.1.2 主要试剂

升华硫，化学纯，天津市福晨化学试剂厂；琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，生化试剂，日本进口；酵母抽提物，生化试剂，日本进口；二苯胺磺酸钠，化学纯，国营昆山化工试剂厂；乙二胺四乙酸钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。

2.1.3 培养基

实验室使用的各种培养基配方如下：

Waksman 培养基[81]：(NH4)2SO4 0.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，S0 10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。

Starky-Na2S2O3-琼脂培养基[81]：(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.25 g，KH2PO4 3.0 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，Na2S2O3 10 g，琼脂3.0 g，蒸馏水1000 mL。

基础培养基：(NH4) 2SO40.2 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.126 g，蒸馏水1000 mL，pH=2.0。

LB培养基：1 g蛋白胨，0.5 g酵母提取物，1 g NaCl，溶于100 mL蒸馏水中，pH=7.0。

2.1.4 缓冲液

[1]STE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6）0.2 mol/L，NaCl 0.5 mol/L，SDS 0.1%，EDTA

0.01 mol/L；

[2]TE缓冲液：Tris-HCl 10 mmol/L（pH7.6），EDTA 0.001 mol/L；

[3]50×TAE缓冲液：242 g Tris碱，57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/mL EDTA(pH

8.0)，加双蒸水至1L。电泳缓冲液常用0.5×TAE缓冲液；

[4]10%SDS溶液：10%（w/w）的十二烷基磺酸钠溶解于蒸馏水中，可加热到

68℃溶解。

[5]醋酸铵缓冲液：取醋酸铵100 g，加水300 mL使溶解，加冰醋酸7 mL，摇

均即得。

2.1.5 酶及试剂盒

[1] 酶：Taq DNA 聚合酶购自武汉鼎国生物技术有限公司，T4DNA连接酶购自Takara公司，溶菌酶，蛋白酶K，Rnase，均为上海生工产品。

[2] 试剂盒：PCR产物纯化试剂盒，GenExtract TM质粒小量快速提取试剂盒，PMD-18 Vector连接试剂盒，均为Takara公司产品；DNA Marker (DL2,000)，Loading buffer购自武汉鼎国生物技术有限公司。

2.1.6 引物合成与测序

扩增16S rDNA的PCR扩增引物为：

Pf：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

Pr：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'

引物由武汉鼎国生物技术有限公司合成，测序由六合华大基因科技股份有限公司完成。

2.1.7 主要仪器设备

表2.1 主要仪器与设备

Table2.1 The main equipments

型号名称生产厂家

3K30型台式冷冻离心机SIGMA

SPX-250B-Z型生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂

HZ200LB型恒温培养摇床武汉瑞华仪器设备责任有限公司

UV-2000型紫外-可见分光光度计龙尼柯（上海）仪器有限公司DELTA 320 pH计Mettle-Toledo Group（上海）有限公司YX280A 手提式不锈钢蒸汽消毒器上海三申医疗器械有限公司

85-2型磁力恒温搅拌器上海司乐仪器厂

FM70型制冰机格兰特公司

PCR仪德国eppendorf公司3K30 台式冷冻离心机SIGMA

2.2 试验方法

2.2.1 土样采集与处理

将取样瓶与取样勺用牛皮纸炸好后，于121 ℃高压灭菌。在取样地点打开牛皮纸，用取样勺取土壤样品至取样瓶中，瓶口在酒精灯焰上灼烧，然后迅速扎好牛皮纸带回。称取土样10 g到盛有100 mL无菌水的烧杯中，加入磁力搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌1 h，然后静置。烧杯和磁子使用前经过高压灭菌，以保证操作过程为无菌操作。

2.2.2 富集培养

从自然界中采集而来的土样样品，虽然其中有硫氧化细菌生存，但自然条件中营养物质相对较少，而且多种微生物在同一环境中共生，形成了一个多种微生物的群落体系[82]。不同种群微生物之间还存在着对有限营养物质的竞争，使得各种菌群之间达到了相对平衡的状态，某一菌群不具有绝对优势，菌浓度一般都低于107个/mL。此外，野生菌的生长活性也比较低，要进行富集培养[83]。富集培养主要是依据微生物生长特性，通过控制培养基及温度等环境条件，使能够适应该条件的微生物旺盛生长[84]，从而数量增加直至成为优势菌种，以更利于从中分离出所需菌种。

吸取土样处理静置后的上清液10 mL，接种到盛有到盛有100 mL 已灭菌Waksman 培养基的250 mL 锥形瓶中，置于30 ℃、150 rpm的恒温摇床中培养。培养7 d～10 d，直至培养基变成浑浊的乳白色。从中吸取10 mL接种到新鲜的Waksman培养基中，如此重复操作，富集培养四五代之后，使得嗜酸氧化硫硫杆菌成为其中的优势菌群。