基因工程-外源基因在哺乳动物细胞中的表达

基因工程
523 416789重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA 技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达
外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化
8.4 高等哺乳动物的基因转移
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.3 高等哺乳动物的载体系统8.2 高等哺乳动物的受体系统8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念8.5 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
高等哺乳动物细胞的生长特性
动物基因工程指利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。

遗传学动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。

非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。

8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
高等哺乳动物基因工程
高等哺乳动物细胞基因表达技术
高等哺乳动物转基因技术
转基因动物个体
动物工程细胞
哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型
人体基因治疗
蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型
8.1.1 高等哺乳动物细胞的生长特性8.1.2 高等哺乳动物受体细胞的条件8.1.3 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记8.1.4 常用的高等哺乳动物受体细胞
8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.1.1 高等哺乳动物细胞的生长特性
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：
锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂
血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代，且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。

有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞称为细胞系。

8.1.2 高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件：
细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存合适的标记便于转化株的筛选和维持生长快且齐分裂周期短，生长均一，便于控制大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。

安全性能好
不合成分泌致病物质，不致癌
基因转移的目的不同，所使用的动物受体细胞也不同。

一般而言，以规模化生产医用重组蛋白为目标的动物工程细胞系构建较为普遍地采用中国仓鼠卵巢（CHO ）细胞、人胚胎肾（HEK293）细胞、非洲绿猴肾（COS ）细胞、幼仓鼠肾（BHK ）细胞、小鼠骨髓瘤（NS0）细胞、人视网膜（PER-C6）细胞等，这些动物细胞大都被改造成能在无血清培养基中以悬浮方式高密度生长的细胞系；
就转基因动物的生成而言，受体细胞主要为动物的早期胚胎细胞、胚胎
干细胞（ESC ）、诱导型多能干细胞（iPSC ）、生殖细胞（GC ，精细胞和卵细胞）或其前体细胞（PGC ，即胚胎原肠胚阶段分化出的生殖祖先细胞）。

高等哺乳动物的受体系统
8.1.4 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
与细菌的DNA 转化系统相比，高等动物细胞的基因转移效率要高很多。

尽管如此，能稳定接纳转基因的转化细胞也只是少数。

因此为了快速有效地分离转化细胞，在通常情况下仍需要建立动物细胞特异性的选择标记，包括营养缺陷型标记和显性遗传标记两大类。

8.1.4 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK ）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT 培养基）生长，载体上的标记基因tk 能与之遗传互补。

含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT ）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT 培养基）生长，载体上的标记基因hprt 与之遗传互补。

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞显性筛选标记
遗传标记
编码产物
筛选药物
作用机理
APH -氨基糖苷磷酸转移酶G418
APH 灭活G418DHFR 二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR 变体抗氨甲喋呤
HPH -潮霉素B 磷酸转移酶潮霉素B HPH 灭活潮霉素B TK -
胸腺嘧啶核苷激酶
氨基喋呤TK 合成TMP XGPRT -黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT 合成GMP ADA -腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷
ADA 灭活Xyl-A
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体和诊断试剂等）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO ），其优势有如下几个方面：
遗传背景清楚，生理代谢稳定
与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养
被美国FDA 确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS ）
8.2 高等哺乳动物的受体系统
8.4.2 哺乳动物细胞的病毒转染法
通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞内，是一种常用的高效基因转移策略。

根据受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。

相对物理和化学基因转移程序而言，病毒转染型基因转移策略的优势在于转染效率高且细胞特异性强，外源基因在细胞内既可独立复制又可随机或区域倾向性整合，病毒基因组天然存在的强表达元件（如启动子、增强子、终止子、PolyA 化信号序列等）能驱动外源基因高效表达；主要缺点是存在野生型病毒颗粒生成的风险以及病毒蛋白对动物体构成免疫原性。

8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.4.2 哺乳动物细胞的病毒转染法
以病毒DNA 为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。

这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。

8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.3 高等哺乳动物的载体系统
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.3.1 腺病毒转染载体8.3.2 猿猴病毒转染载体
8.3.3 人乳多瘤病毒DNA （BKV ）8.3.4 牛痘病毒转染载体
8.3.1 腺病毒转染载体-腺病毒DNA
有（腺病毒科为线状双链DNA 病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。

目前已鉴定的人腺病毒6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C 亚属的2型（Ad2）和5型Ad5）病毒。

腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。

腺病毒的生物学特性
人腺病毒DNA
腺病毒的基因组DNA
ITR
ITR
E1E2E3E4
IVa2
VA
L1
L2
L3
L4
L5
腺病毒基因组DNA 全长36 kb ，其包装上限为原基因组的105%，DNA 两端各有一个反向重复序列（ITR ）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA 均为病毒RNA 聚合酶的亚基编码基因。

E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb 的片段，使得载体的装载量提高到4 kb 以上。

人腺病毒DNA
基因重排低外源基因与病毒DNA 重组后能稳定复制几个周期腺病毒DNA 载体的特点
安全性能好不整合人的染色体DNA ，不会导致恶性肿瘤发生
宿主范围广对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好外源基因在载体上容易高效表达
转染效率高和重组病毒滴度高，每毫升细胞培养物可达1012~1013个病毒颗粒
腺病毒载体最大的缺陷是重组的外源基因不能持久表达，而且病毒蛋白对体液和Ｔ淋巴细胞具有免疫原性
猿猴多瘤病毒DNA （SV40）
VP3其最早的动物病毒载体是以猿猴病毒（SV40）的双链环状DNA 为蓝本构建的。

SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp 的双链环状DNA 。

SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使DNA 形成类似核小体的微型染色体结构。

腺病毒感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。

SV40的生物学特性
猴多瘤病毒DNA （SV40）
SV40的基因组DNA
t / T 基因编码病毒的小抗原和大抗原与
病毒的致癌作用密切相关。

SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，
每个宿主细胞含有105个病毒DNA 拷贝，因
此十分适合用于高效表达外源蛋白。

SV40 DNA
ori
VP2
T VP3
VP1
t
猴多瘤病毒DNA （SV40）
SV40 DNA-质粒DNA 杂合载体的构建
重组的SV40 DNA 分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA 片段不能太大。

为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。

Ap r
ori
viral gene
gpt
SV40 ori
pV2-GPT
pBR322
pBR322
SV40 pV2-GPT 是一种SV40 DNA 与大肠杆菌质粒DNA 杂合的载体，其中gpt 为细菌来
源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。

该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b -珠蛋白。

猴多瘤病毒DNA （SV40）
利用SV40 DNA 载体表达外源基因的程序
SV40 载体
病毒晚期基因启动子
筛选标记
ori
缺陷的SV40 辅助病毒
插入外源基因
重组分子
分离病毒DNA
转化
筛选
增殖
感染
猿猴多瘤病毒DNA （SV40）
首先将外源基因克隆在病毒/细菌杂合质粒上的SV40晚期基因启动子下游，
然后从重组质粒上切下外源基因表达盒及病毒DNA 部分。

将此重组片段与另一早期基因缺陷的辅助病毒DNA 共转染受体细胞，接纳
了上述两种DNA 分子的转化细胞能合成病毒包装蛋白，并将自主复制的两种DNA 分子分别装配成具有感染力的辅助病毒和重组病毒颗粒。

受体细胞裂解后，释放出的成熟病毒再感染其他的猿猴细胞。

SV40表达外源基因的一般程序
猴多瘤病毒DNA （SV40）
基因表达好外源基因能高效表达
SV40 DNA 载体的特点
基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄只能转染猴细胞装载量较小
人乳多瘤病毒DNA （BKV ）
组为双链主复制，每个宿主细胞最高可达人乳多瘤病毒（BKV ）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因DNA ，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自500个拷贝。

人乳多瘤病毒的生物学特性
人乳多瘤病毒DNA （BKV ）
人乳多瘤病毒表达载体的构建
BKV -E.coli 穿梭载体
BKV ori
BKV gene
DRE MMTP
Ap r
E.coli ori SV40 P
Neo r
删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。

安装细胞色素P450 dioxin 介导的增强
子DRE ，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP ，由其带动外源基因的表达。

SV40来源的启动子控制Neo r 标记基因，以G418筛选重组子。

以此载体在人细胞系中表达b 1-干扰素和单纯疱疹病毒B 蛋白获得成功。

人牛痘病毒DNA
人牛痘病毒是一个大型DNA 病毒，基因组长185 kb ，能在宿主细胞质中自主复制。

以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建出的重组病
毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。

然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA 重组很困难，因此通
常采用体内重组的方式进行。

人牛痘病毒的生物学特性
人牛痘病毒DNA
目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA 聚合酶编码基因。

在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量
表达T7RNA 聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA 上，并在T7RNA 聚合酶的作用下表达出重组蛋白。

人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的
人牛痘病毒DNA 表达载体的构建
人牛痘病毒DNA
利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序
牛痘病毒启动子T7 RNA 聚合酶基因
T7启动子
外源基因
细菌重组质粒
感染转化培养
收集
8.4 高等哺乳动物的基因转移
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
8.4.2 哺乳动物细胞的病毒转染法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。

但转基因进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA 上，导致受体细胞基因的插入型灭活或转基因因整合位点处的异染色质屏蔽效应而不表达。

8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
DNA 显微注射是动物细胞基因转移普遍采用的一种物理转化方法，1981年首先在小鼠受精卵中获得成功。

具体程序如下：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；用吸管将受精卵固定在倒置显微镜上，然后借助直径通常为0.5~5μm 的玻璃注射针依序穿过受精卵透明带、卵母细胞质膜、雄性原核核膜并注入DNA 溶液。

将25~40个注射了DNA 的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。

DNA 显微注射法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
进入细胞核内的转基因借助细胞DNA 修复途径随机整合在受体细胞的基因组中，但
整合效率通常只有1%~4%。

对此的改进措施是将外源DNA 与限制性核酸内切酶共注射，后者通过切割基因组DNA 而高效激活受体细胞的DNA 修复途径，由此提高转基因的整合效率。

对于那些雄性原核不易看清的动物胚胎（如家畜、两栖类和鱼），也可将外源DNA 注射进卵母细胞核内或者简单注射在受精卵胞质中，但转基因的核转位极其低效。

DNA 显微注射法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
DNA 显微注射法的优势包括：
适用物种范围广泛、
实验周期短、
转基因表达盒无需专门的载体、转基因长度可达数百kb ；
DNA 显微注射法的劣势包括：
操作技术复杂。

但转基因的整合会导致受体细胞基因组重排、易位、缺失或点突变，且操作技术复杂。

DNA 显微注射法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时对于精细胞、卵母细胞、胚胎细胞以及其他转移程序难以奏效的某些类型的细胞（如在培养基中悬浮生长的淋巴细胞）可采用电击法进行转化。

将待转化的DNA 溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两DNA 片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。

电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。

DNA 电击转化法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
将受体细胞以加入在盛有上述悬浮液的电击杯两端施加短暂的脉冲电场（50nF 电击转化率因细胞类型和电击操作条件不同相差上千倍，每至少高基本操作程序如下：
(1)
1×107~2×107个细胞／mL 的浓度悬浮于冰冷的磷酸盐缓冲液中；1~2 μg/mL 待转化的DNA 溶液；
(2)
2.0~4.0kV ，0.9~300mA ，
），使细胞膜产生细小的孔洞并增加其通透性，此时外源DNA 片段便能不
经胞饮作用直接进入胞质。

(3)106个活细胞可产生
0.3~300个转化子。

一般而言，线形DNA 因整合的高效性其转化率比环状DNA
20倍；
DNA 电击转化法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
基本操作程序如下：
(4) 0℃电击条件因细胞存活率较高其转化率为20℃的6~16倍；
(5) 在电击转化之前用亚致死浓度的秋水仙胺处理细胞比不处理的转化率高2~10倍，
其原因可能是暂停于间期的细胞缺乏完整的核膜或者核膜通透性增加而有利于转基因的核转位。

DNA 电击转化法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
优点：操作简便，实验周期短，适用细胞类型广；缺点：转移DNA 的片段长度受到严格限制；
与显微注射法一样不适合生产规模的大体积细胞培养物操作；且同样具有转基因核转位低效以及随机整合等缺点。

DNA 电击转化法的优缺点
8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法裸露的DNA 进入哺乳动物细胞是一个非常低效的过程。

为了提高转化率，可使用一些天然或合成的化学试剂压缩包裹DNA ，促进其与细胞膜的结合并进入细胞；同时也能保护外源DNA 免遭细胞内核酸酶的攻击，使其完整地进入细胞核。

8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法
合，此时最早的动物细胞转化方法是将外源DNA 与DEAE 葡聚糖等高分子碳水化合物混DNA 链上带负电荷的磷酸骨架能吸附在DEAE 的正电荷基团上，形成含DNA 的大颗粒。

后者黏附于受体细胞表面，并通过其胞饮作用进入细胞内，但这种方法对许多类型细胞的转化率极低。

受二价金属离子能促进细菌细胞吸收外源DNA 的启发，针对哺乳动物细胞简便有效的磷酸钙（CaPi ）共沉淀法也得以建立。

磷酸钙共沉淀法
8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法
将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，将待转化的DNA 溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl 2溶液混匀，此时DNA 被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；
37℃保温4-16小时；除去DNA悬浮液，加入新鲜培养基；
此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA 便进入受体细胞；弃去DNA 溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。

磷酸钙共沉淀法
8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法
细胞内，由于囊泡中高浓度的钙离子或有丝分裂期间，由于核膜分解结果显示，加入细胞培养物的磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒值得注意的是，在无渗透压休克时，在上述过程中，CaPi-DNA 共沉淀颗粒通过胞饮作用并以囊泡的形式进入受体细胞。

在pH 降低致使囊泡破裂，质粒DNA 被释放至胞质中。

在DNA 可进入核内。

采用叠氮溴乙锭和荧光肽核酸标记技术检测DNA 中大约5%能被受体细胞接纳，而且每个细胞可同时接纳10万个外源DNA 分子。

在某些转化条件下，DNA 能转移至80%~90%的HEK293细胞中，然而定位于细胞核中的完整DNA 分子低于10%。

尽管如此，这一程序的转化率至少是DEAE 葡聚糖法的100倍。

采用DNA ，可使正常细胞转变为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早认识。

CaPi-DNA 共沉淀法对CHO 细胞效果欠佳；共沉淀形成的时间敏感性使得CaPi 在介导大体积细胞培养物转化时存在技术挑战性；另一个重要限制是在转化培养基中需要血清，以防止共沉淀长大并集聚成无效的复合物。

磷酸钙共沉淀法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
聚乙烯亚胺（PEI ）可由氮杂环丙烷或2-乙基-2-唑啉单体缩合而成，分别形成分支形或直线形聚合物。

早在20世纪70年代初便发现PEI 能沉淀DNA ，但20年后才被用于有效投送DNA 至各种哺乳动物细胞系中。

与DEAE 葡聚糖相似，PEI 因呈高密度的正电荷而能有效压缩DNA 分子。

由于这种DNA-PEI 复合物仍带有净的正电荷，因而能与动物细胞表面上的负电荷型糖蛋白、蛋白多糖、硫酸化蛋白多糖非特异性相互作用。

与磷酸钙DNA 共沉淀颗粒一样，DNA-PEI 复合物优势借助胞饮作用进入细胞，并在随后见于早期/晚期核内体以及一些内吞型溶酶体中。

动物细胞捕获DNA-PEI 复合物是一个相对高效的过程，将复合物加入培养物中3h 后便能在所有细胞中检测到其存在。

聚乙烯亚胺转化法
8.4.1 哺乳动物细胞的物理转化法
有证据显示，PEI 通过所谓的“质子海绵效应”从囊泡中逃逸，即PEI 能缓冲核内体的内环境，进而延迟酸化以及与溶酶体的融合，最终导致渗透性膨胀以及一些囊泡的破裂，将DNA-PEI 复合物释放至胞质中。

研究表明PEI 还能促进外源DNA 分子由胞质向核内的转移，导致其转化率高达
40%~90%。

不过值得注意的是，DNA-PEI 复合物从核内体中释放的速度以及更为重要的复合物进入核内的速度呈细胞类型依赖性，这两个速度是限制转基因表达的重要因素。

聚乙烯亚胺转化法
8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法
将待转化的DNA 溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA 的脂质体结构。

将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA 随即进入胞质和核内。

利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa 细胞。

脂质体介导法
采用商品化的阳离子脂质体试剂转化CHO细胞转化率高，且转基因呈高效表达，但这些试剂价格通常比PEI高数千倍，而且对某些细胞具有毒性，因而一般只用于实验室研究以及构建转基因动物。

8.4.2 哺乳动物细胞的化学转化法
脂质体介导法
8.5 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
8.5.1 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理8.5.2 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体8.5.3 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂8.5.4 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII
8.5.1 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
素（自20世纪80年代初第一例重组蛋白人胰岛素投入市场以来，美国
FDA 已批准了100多种重组医用蛋白用于临床治疗，其中相当一部分重组产品是采用哺乳动物细胞或个体生产的。

很多重组蛋白如组织型纤溶酶源激活剂（t-PA ）和促红细胞生成EPO ）的生物功能需要糖基化之类的翻译后修饰；
大多数单克隆抗体的糖基化对其最佳功能的发挥以及药代动力学特征也至关重要。

8.5.1 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
虽然大肠杆菌、酵母、昆虫表达系统已按照人类蛋白质翻译后修饰模式进行了相应的工程化改造，但其翻译后修饰的完美程度和效率仍不及哺乳动物细胞。

目前，在生物反应器中规模化培养的哺乳动物细胞生产重组单克隆抗体以及Fc 融合蛋白的水平已达到10~15 g/L ，丝毫不逊于其它表达系统。

8.5.1 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
采取物理或化学转化程序尤其是借助重组病毒转染方法，将编码重要医用蛋白的基因导入合适的高等动物受体细胞内，并使之整合在基因组中，进而通过筛选程序构建转基因遗传稳定的生产型工程细胞系，是高等动物基因工程生产重组异源蛋白的一种策略。

这种策略的优势在于能从细胞克隆群（因转基因重组载体的随机整合而形成）中选择使用转基因表达水平最高的克隆，并对这些优势克隆进行生产工艺的优化。

尽管这个过程需要花费几个月的时间，但它仍被广泛用于产业化过程中。

•用于规模化生产重组医用蛋白（如重组人干扰素INF 和tPA ）的第一个也是迄今为止使用最普遍的高等动物遗传稳定型工程细胞系是源自1957年发现的具有分裂永生性的CHO 细胞系。

8.5.1.1 用于规模化生产重组医用蛋白的高等动物细胞系
•CHO 细胞系具有如下优势：
①与其他用于医用蛋白生产的哺乳动物细胞系一样，能以接近于人类蛋白质的糖基化方式修饰其表达的重组蛋白产物；②能在生物反应器中以悬浮的方式高密度生长；③传播人类病毒的风险较低，因而较为安全；
④相对其他候选细胞系拥有可塑性较大的基因组，便于基因扩增和遗传操作；
⑤与其他细胞系一样，易为表达目标蛋白的重组基因载体所转染；⑥涉及基因转染、筛选、规模化培养的工业生产过程业已建立。

8.5.1.1 用于规模化生产重组医用蛋白的高等动物细胞系
•来自人类视网膜的PER-C6细胞系是一种具备真正意义上的人糖基化
及其它翻译后修饰机器的受体系统，对生物药物产业颇具吸引力；•该细胞系无需基因扩增或选择标记，在短短几个月内便能建立起高
产性的稳定克隆，且低拷贝足以维持稳定高效的转基因表达。

在流加式分批培养中，该细胞系便能生产高于2 g/L 的重组蛋白；•在连续培养中，该细胞系可在高密度（>1.5×108个细胞/mL）条件下
达到25 g/L 的体积产率。

•在上述过程中，细胞均在搅拌罐式生物反应器中以悬浮方式生长。

而且，PER-C6工程细胞系还能在单个细胞中联合表达具有相同轻链的三种不同类型的重组抗体。

8.5.1.1 用于规模化生产重组医用蛋白的高等动物细胞系
8.5.1 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
整合在受体细胞基因组中的转基因除了可采用上述启动子、增强子、
Kozak 序列、IRES 位点、UCOE 位点等基因表达元件促进其表达外，在基因组中的原位扩增也是转基因高效稳定表达的一种有效方式。

研究发现，CHO 细胞培养物经DHFR 特异性抑制剂MTX 处理后，绝
大多数细胞死亡，但在极少数存活下来的抗性细胞中dhfr 基因呈扩增现象。

这些细胞正是通过增加相关基因的拷贝数提高关键代谢酶的表达水
平，从而抵消MTX 的抑制作用。

旨在提高转基因拷贝数的高等动物基因扩增原理。