免疫组织化学

免疫组织化学得基本知识

1免疫组织化学得概念:

免疫组化就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为免疫组织化学。ﻫ2免疫组化实验所用得抗体有哪些？ﻫ免疫组化实验中常用得抗体为单克隆抗体与多克隆抗体。单克隆抗体就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个Ｂ淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物。ﻫ3免疫组化实验所用得组织与细胞标本有哪些？ﻫ实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,细胞标本包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片。

其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本得方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定得影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选得组织标本制作方法、ﻫ4石蜡切片为什么要做抗原修复?有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行I ＨC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成得交联破坏,而恢复抗原得原有空间形态、ﻫ常用得抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用得修复液就是pH６.０得0.0１ moｌ/L得柠檬酸盐缓冲液。

5免疫组化常用得染色方法有哪些? ﻫ根据标记物得不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础得检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细

6抗体交叉反应得原胞水平得定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。ﻫﻫ

因:

指抗体除与其相应得抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生得原因有以下几个方面:

1、抗原特异性指用于免疫动物得抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产

生针对多种抗原分子特异性得相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同得抗原分子,必将与上述多特异性得抗血清发生交叉反应。ﻫ２。共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同得抗原决定簇。ﻫ3、决定簇相似,两种不同得抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇得相应抗体可以与大致相同得决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时得结合力小于吻合时得结合力。ﻫﻫ免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术得概述ﻫ＊免疫细胞化学(immunｏcytocｈemｉｓ

try, ICC) ﻫ—就是利用抗原与抗体特异性结合得原理,通过化学反应使标记抗体得显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原得成分(主要就是多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量得研究,称为~。

ﻫ(一) 对抗原与抗体得要求ﻫ＊具有特异性高与亲与力强得抗体就是实验成功得首要条件。

－对抗体得要求:纯度高、比活性强; ﻫ＊高度特异性抗体得获得,取决于抗原得纯度。

-对抗原得要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。

ﻫ(二) 抗原 (ａntigen, Ag) ﻫ＊抗原得概念:凡就是在机体内引起体液免疫与(或)细胞免疫反应得物质,称为抗原。抗原具有两个方面得特性:

－免疫原性:引起机体产生抗体与(或)致敏淋细胞得特性; ﻫ—免疫反应性:抗原能与相应得抗体及致敏淋巴细胞发生特异得结合或反应得特性。

＊根据抗原就是否显示免疫原性分为:

—完全抗原:分子量较大,一般在1０kDa以上,并具有较复杂得化学组成。

*免疫原性最强得就是蛋白质抗原,多糖次之;脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好得免疫原性。

—半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂与药物等、ﻫ＊半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。

载体ﻫ＊通常就是具有高度免疫原性得大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联得半抗原能力。

-常用得载体有钥孔血蓝蛋白(kｅyhｏle ｌiｍpｅt hｅｍocyanｉｎ,ＫLH)、牛血清白蛋白(bovｉnｅ seruｍａlｂumin, BSA)、卵白蛋白(Ovaｌｂumin,ＯVＡ)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、—COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kＤa结合５～２5个分子得小肽、

(三)抗体 (antibody, Ab)

1、抗体得概念: ﻫ＊机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合得球蛋白,被称为抗体。ﻫ-抗体主要存在于血清内; ﻫ－抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体、

-免疫球蛋白根据重链得结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、ＩgD、IｇE、 I ｇA、IgM。

ﻫ2、免疫组化实验中常用得抗体:单克隆抗体与多克隆抗体。ﻫ*单克隆抗体:就是一个B淋巴细胞克隆分泌得抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备得、

-特异性强、抗体产量高。

＊多克隆抗体:就是将纯化后得抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得得免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生得抗体混合物。

－特异性低,会产生抗体得交叉反应。ﻫ－多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。ﻫ—抗原与抗体得结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。

３、抗体得制备——多克隆抗体得制备

＊动物得选择ﻫ*佐剂(adｊuvanｔ) ﻫ＊免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价得测定ﻫ*放血或定期抽血

免疫组化常见问题及解决方法

当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能得原因。ﻫ对照/标本无染色

①确认就是否忽略了应该加得某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。

ﻫ②确认所有得试剂就是否按正确得顺序加入,就是否孵育了足够得时间。