实验二_ PEG-磷酸盐双水相体系相图的绘制及萃取分配平衡实验
生物分离 双水相萃取试验指导
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，通系电1，力过根保管据护线生高0不产中仅工资2艺料22高试2可中卷以资配解料置决试技吊卷术顶要是层求指配，机置对组不电在规气进范设行高备继中进电资行保料空护试载高卷与中问带资题负料2荷试2，下卷而高总且中体可资配保料置障试时2卷，32调需3各控要类试在管验最路；大习对限题设度到备内位进来。行确在调保管整机路使组敷其高设在中过正资程常料1工试中况卷，下安要与全加过，强度并看工且25作尽52下可22都能护可地1关以缩于正小管常故路工障高作高中；中资对资料于料试继试卷电卷连保破接护坏管进范口行围处整，理核或高对者中定对资值某料，些试审异卷核常弯与高扁校中度对资固图料定纸试盒，卷位编工置写况.复进保杂行护设自层备动防与处腐装理跨置，接高尤地中其线资要弯料避曲试免半卷错径调误标试高方中等案资，，料要编试求5写、卷技重电保术要气护交设设装底备备置。4高调、动管中试电作线资高气，敷料中课并设3试资件且、技卷料中拒管术试试调绝路中验卷试动敷包方技作设含案术，技线以来术槽及避、系免管统不架启必等动要多方高项案中方；资式对料，整试为套卷解启突决动然高过停中程机语中。文高因电中此气资，课料电件试力中卷高管电中壁气资薄设料、备试接进卷口行保不调护严试装等工置问作调题并试，且技合进术理行，利过要用关求管运电线行力敷高保设中护技资装术料置。试做线卷到缆技准敷术确设指灵原导活则。。：对对在于于分调差线试动盒过保处程护，中装当高置不中高同资中电料资压试料回卷试路技卷交术调叉问试时题技，，术应作是采为指用调发金试电属人机隔员一板，变进需压行要器隔在组开事在处前发理掌生；握内同图部一纸故线资障槽料时内、，设需强备要电制进回造行路厂外须家部同出电时具源切高高断中中习资资题料料电试试源卷卷，试切线验除缆报从敷告而设与采完相用毕关高，技中要术资进资料行料试检，卷查并主和且要检了保测解护处现装理场置。设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
双水相萃取相图制作实验
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
双水相
5、萃取因素与理论收得率
6、影响K的因素
影响分配系数的因素： 系统本身的因素：系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和
离子强度、pH等。 目标产物的性质：疏水作用、电荷、分子量等。
（1）、PEG分子量 α-淀粉酶的分配系数随PEG分子量的增加而降低，
在低分子量PEG时，α-淀粉酶的分配系数高，α-淀粉酶主 要集中在上相；而随着PEG分子量的增加，分配系数K值 降低，甚至α-淀粉酶分配到下相。
（3）逐渐加入无机盐原液，混合，直至试管出现混浊。 称重，计算加入的无机盐量（g） 。
（4）逐滴再加入蒸馏水，震荡，使浑浊的两相系统“刚 刚变澄清”，称重，计算出系统总质量（W1- W0 ，g） 。
（5）计算出系统中PEG和无机盐的质量浓度（无机盐%, PEG%）。
（6）在坐标系中绘出第一个坐标（无机盐%, PEG%） （7）继续向试管中加入无机盐，使系统再次变混浊， 称重，然后逐滴加水、震荡，使系统“刚刚澄清”，称重， 计算出澄清时系统中的PEG和无机盐的质量浓度，然后， 在坐标系中绘出第二个坐标点。如此反复操作，绘出多个 坐标点。 （8）连接多个坐标点，得到相图。
液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。
3、 操作步骤
3.1 待测酶液的制备 待测样品用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，
供测定用。
3.2 测定 取2ml标准终点色溶液滴于白磁板空穴内，作为比较
颜色的标准。 取20ml 2%可溶性淀粉和5m1 pH6.0 磷酸氢二钠-柠
檬酸缓冲液，放于20×200mm大试管中，在60℃恒温水 浴中预热4-5min．然后加入预先稀释好的酶液0.5m1，立 即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取出反应液约0.5m1， 滴于预先充满比色稀碘浓(约1.5ml)的磁扳空穴内，当穴内 颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点色相同时， 即为反应终点，并记录时间t (min)。
双水相萃取相图制作实验
实验一：双水相萃取的相图制作一、试验目的1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。
二、试验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。
常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。
相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。
连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。
系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ三、主要仪器设备漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平四、试验步骤1 双水相系统的制作精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。
另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。
然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。
如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。
2 相图的绘制以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
五、注意事项1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。
双水相萃取系统相图制作新方法
双水相萃取系统相图制作新方法
高向阳;穆洪涛;方颖
【期刊名称】《实验室研究与探索》
【年(卷),期】2017(036)003
【摘要】相图是研究双水相萃取分离过程的重要前提步骤,提出了清-浊点辅助相图制作方法,采用移液器微量滴定的方法绘制了PEGs/(NH4)2SO4的双水相相图,经准确度验证,此方法准确可靠.清-浊点辅助相图制作法具有操作简便、快速、准确和适用范围广等特点,为双水相系统相图制作提供了新的方法,可以用于双水相萃取的实验教学、科研及生产等领域.
【总页数】4页(P16-19)
【作者】高向阳;穆洪涛;方颖
【作者单位】华南农业大学食品学院,广州510642;广东第二师范学院生物与食品工程学院,广州510303;华南农业大学公共基础课实验教学中心,广州510510【正文语种】中文
【中图分类】TP212
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双水相体系配制与萃取实验报告
双水相体系配制与萃取实验报告标题：双水相体系配制与萃取实验报告摘要：本文旨在介绍双水相体系的配制和萃取实验，并从多个方面深入探讨双水相体系的原理、优势以及在化学实验中的应用。
通过配制不同体积比例的两相溶液，我们将研究它们在不同环境下的相互作用和分离效果。
本实验对于理解双水相体系的应用潜力以及深入探索其在分离和萃取过程中的优势具有重要意义。
1. 引言在化学实验中，分离和提纯目标物质是一项重要的任务。
传统的溶剂萃取方法虽然广泛应用，但常常存在一些限制，例如有毒有害溶剂的使用、低分离效率以及操作复杂等。
为了克服这些问题，双水相体系应运而生。
双水相体系是指由两种不相溶的水溶液组成的体系，其特点是分子间相互作用较弱，不需要有害溶剂参与，能够更高效地完成分离和提取任务。
2. 双水相体系配制的方法为了成功配制双水相体系，我们需要选择适当的双水相体系成分，并正确调配它们的比例。
在实验中，我们通常使用两种水溶液，例如磷酸盐溶液和盐酸溶液。
在配制过程中，可以采用逐滴法、加水法或溶剂辅助法等方法，以确保两相溶液的水平接触，并形成稳定的双水相体系。
3. 双水相体系的原理和特点双水相体系的形成是由于两相溶液中存在的一些化学成分之间的亲疏性差异所致。
一般来说，一种水相溶液中的一类极性物质与另一种水相溶液中的另一类亲疏性物质之间存在强烈的相互作用。
这种相互作用可以通过水相中所含的盐的类型、浓度以及 pH 值的调整来控制。
与传统的单相溶剂萃取相比，双水相体系具有好的相容性、高的分离效率、可重复使用等特点。
4. 双水相体系在化学实验中的应用双水相体系在化学实验中有着广泛的应用。
它可以用于生物大分子的提取和分离、金属离子的萃取、有机物的净化等。
利用双水相体系的亲疏性差异，我们可以实现对目标物质的高效提取，并能够在分离过程中控制环境条件，如pH 值、温度等，以满足特定实验需求。
此外，双水相体系还可以减少有毒溶剂的使用，减轻对环境的影响。
实验：PEG400(NH4)2SO4两水相系统的相图
移液枪或移液管
四、操作方法
（一）溶液配制（已配制）
配制43%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称适量 硫酸胺
少量水 溶解
稀释
密度 1.2g/ml
密度计 测密度
（二）相图的制作（浊点法）
PEG400 0.7g
H2O 0.5ml
(NH4)2SO4
V盐(ml) m盐(g)
纯(NH4)2SO4 累计量
m’(g)
溶液累 计总量 m总(g)
1 0.5 2 0.3
(NH4)2SO4溶液累计加量V盐(ml)=滴定后读数-初始读数 (NH4)2SO4溶液累计加量m盐(g)=ρ* V盐=1.2* V盐
3 0.3
纯(NH4)2SO4累计量m’(g)=43%* V盐
但是只有达到一定的浓度时，才能形成两相。
两水相的成相条件和定量关系——相图表示。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、实验原理
❖ 相图：一根双节线，把均相区和两相区分隔开来。
当成相组分的配比取在: ➢曲线的下方时，为均相区； ➢曲线的上方时，为两相区； ➢在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。
上相聚合物 均相
两相
相图是研究两水相萃取的基础。
下相化合物
二、实验原理
M：系统组成 T：平衡时上相组成 B：平衡时下相组成 TMB：系线
➢同一条系线上各点系统
组成不同，但平衡后分成 的两相组成相同，体积比 不同，上下相体积比：
P/%
VT / VB = BM / MT
Q/%
三、实验器材与试剂
❖ 试剂： PEG400、蒸馏水、43% (NH4)2SO4
4.3双水相萃取
相体系萃取分离技术在生物物质分离
中的独特优点.
双水相系统相图的测定
可由实验来测定。 将一定量的高聚物P浓溶液置于试管内，然后用已知浓度的高聚物 Q溶液来测定。
随着高聚物Q的加入，试管内的溶液由均相突然变浑浊。记录高 聚物Q的加入量。
然后再在试管内加入1ml水，溶液变澄清，继续滴加高聚物Q，溶 液又变混浊，记录高聚物Q的加入量；
以此类推，由实验可测定出一系列双节线上的平衡组成，进行数 据整理，计算出各组数据；
以高聚物P的浓度对高聚物Q的浓度作图，即可得到双节线。相图 中的临界点K是系统上相、下相组成相同时由两相转变为均相的 分界点。
双水相萃取的原理
与液液萃取原理相似，依据物质在两 相间的选择性分配，但萃取体系的性 质不同。 当物质进入双水相体系， 依据悬浮粒 子与其周围物质具有的复杂的相互作 用：
Z Z K B 、K A —正、负离子在两相的分配系数；
Z 、Z —盐的正、负离子价； F —法拉第常数
带电的蛋白质在两相的相间电位亦服从上式。
在上述含盐的双水相体系中，蛋白质溶质要受两相电
位差的影响，在两相的分配系数为：
蛋白质的 分配系数
蛋白质在 零界面势 系统中的 分配系数
蛋白质的 静电荷
大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于： (1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温
下蛋白质不会发生变性;
(2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3) 常温操作节省冷却费用.
影响双水相系统萃取过程的因素
两相界面宽度愈大、两相间的密度差愈大、两相间 的表面张力愈大，则愈利于分相 ，但不利于两相的 被分离物在两相间的传质而分配，双水相系统萃取 （除了亲和双水相系统萃取）涉及化学反应少。
双水相萃取技术
（四）亲和作用
• 通过一定的方法，将配基连接在双水相的成 相物质分子上，就构成了具有亲和性质的双 水相体系，形成对被分配物质的亲和作用， 调节待提取物在两相中的分配，从而提高其 分离效果
• 过渡金属离子:Cu2＋、Ni2＋、Fe2＋、Zn2＋、 Co2＋等是常用的亲和配基
• 作用机理:配位键力、π-键及静电作用力
• K+ < Na+ < NH4+ < Li+ < (C4H9)4N+ • ClO4- < SCN- < I- <Br- < Cl-< CH3CO2- < F- <
H2PO4- < HPO42-
（二）疏水作用
• 一般情况下，蛋白质的表面均存在疏水区，疏水 区所占比表面越大，其疏水性越强。不同组分由 于其表面疏水性的差异使得其各自在上下相中产 生相应的分配平衡。
• 对于同种聚合物而言，其疏水性随相对分 子质量增加而增加
• 若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG聚合物，应(?? )它的平均相对分子质 量。
（三）成相聚合物的浓度
• 聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零,此时分配系数为1，即组分均匀的 分配于上下相.
• 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系线的长度增加，系统 远离临界点，成相聚合物两相性质的差别 也增大，组分在两相中的分配系数改变。
第二节 双水相分配原理及其理论基础
• 一、双水相系统分配原理 • 是否会形成双水相，取决于混合熵增和分子间作
用力两个因素。 • 混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力则
随分子量的变大而增强。 • 当两种高分子聚合物之间互不相溶时，由于相对
双水相萃取分离蛋白酶
2、相 图
4、分配系数：
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配 系数。
K=Ct/Cb
5、萃取因素与理论收得率
6、影响K的因素
影响分配系数的因素： 系统本身的因素：系统组成、聚合物分子量、聚
合物浓度、盐和离子强度、pH等。 目标产物的性质：疏水作用、电荷、分子量等。
（1）、PEG分子量 蛋白酶的分配系数随PEG分子量的增加而降低，在低
（一） 相图的绘制
1、两相物质的准备 上相：不同分子量的PEG（600，4000，6000，20000），
配制成原液或直接采用固体试剂； 下相：无机盐制成一定浓度原液，或采用固体试剂。 A、磷酸钾 B、硫酸铵 C、硫酸钠
2、操作
（1）取大试管一支，称重（W0）. （2） 准确称量一定重量的PEG原液，加入试管中，计 算出加入的PEG 的量（g）。
（4）、离子强度
例如：在相组成为PEG4000（15%w/w）磷酸盐 （10%w/w）时， 在较低NaCl浓度时，蛋白酶的分配系数随 NaCl浓度增加而减小，在1% w/w NaCl时达到最低，继续增 加NaCl浓度，蛋白酶的分配系数随NaCl浓度增加而增加，在 7.8% w/w时达到最大。继续增加NaCl浓度，蛋白酶的分配系 数又趋下降。这是由于Na+ 和Cl-在两相分配情况不同，从而 引起两相电位差的变化所致。
（三）扩展实验（选作）
如果你感兴趣，你还可以采用单因素实验或PB实验， 研究PEG分子量，pH值、酶液浓度、离子强度对K与收率 1-φ的影响，然后采用正交试验或响应面实验进行工艺优化。
4、从浑浊变澄清时，要注意“刚刚澄清”。
作业：
1、采用Excel 软件，在同一个图中绘出不同相系统 的双节线（相图）。
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
双水相体系配制与萃取实验报告
双水相体系配制与萃取实验报告一、实验目的本实验旨在掌握双水相体系的配制方法及其在萃取中的应用，了解萃取原理，熟练掌握萃取方法。
二、实验原理1. 双水相体系双水相体系是指两种不相溶的水溶液混合后形成两个互不混合的层。
常见的双水相体系有三种：乙醇-盐酸、聚乙二醇-硫酸和磷酸盐-硫酸。
其中以乙醇-盐酸为例，当乙醇和盐酸混合时，由于两者极性不同，无法完全混合，形成两个不同密度的液相。
2. 萃取原理萃取是利用不同物质在溶剂中的溶解度差异而进行分离纯化的方法。
常用于分离提纯化学物质或生物物质。
在双水相体系中，可以利用两个不同密度的液相进行分离。
三、实验步骤1. 配制双水相体系将10mL浓盐酸加入50mL 95%乙醇中，搅拌均匀。
2. 萃取实验将10mL橙黄色染料加入双水相体系中，轻轻摇晃容器使其混合均匀。
观察到橙黄色染料被分配到乙醇相中。
3. 分离两相用滴管吸取乙醇相，移至干燥的试管中。
用水洗涤滴管后再吸取盐酸相，移至另一个干燥的试管中。
4. 检测分离后的物质在乙醇相中加入少量氢氧化钠溶液，观察到橙黄色染料变成了蓝色。
在盐酸相中加入苯胺溶液，观察到产生了沉淀。
四、实验结果通过本次实验，成功配制出了乙醇-盐酸的双水相体系，并利用该体系进行了萃取实验。
观察到橙黄色染料被分配到乙醇相中，并成功分离两个不同密度的液相。
最终，在乙醇相中检测到了蓝色染料，在盐酸相中检测到了沉淀。
五、实验思考1. 双水相体系的应用有哪些？双水相体系可以用于萃取、分离和纯化生物大分子，如蛋白质、DNA和RNA等。
此外，还可以用于制备纳米材料、催化剂和药物等。
2. 萃取实验中为什么要加入氢氧化钠溶液和苯胺溶液？氢氧化钠溶液可以使橙黄色染料变成蓝色，从而检测出乙醇相中的染料。
苯胺溶液可以与盐酸反应产生沉淀，从而检测出盐酸相中的物质。
3. 双水相体系如何选择？选择双水相体系应考虑所需分离物质的性质和目标纯度。
不同双水相体系对不同物质有不同的选择性，因此需要根据实际情况进行选择。
双水相系统相图的制备
• 从图l可以看出，PEG／磷酸盐双水相系统的上相 中富含PEG，下相中富含磷酸盐．随着整个相系统 浓度的增大，系线变得越长，即上、下相的组成 差别越大，上相中所含有的PEG越多而磷酸盐越少， 下相中则含有更多的磷酸盐而更少的PEG，因此， 上、下相的物理化学性质(如密度、粘度)的差别 也越来越大
相图中在双结点曲线(binodal curve)下方的 点表示的组成只能得到单相系统，而在其上 方的点表示的组成则可以得到两）相图 中的点C上，两相的组成变为相 同，两相变为一相．系线(tielines)TMB联结 相互平衡的两相，系统M 相分离后可以得到 相T和下相B，并且上、下两相的质量比遵循 杠杆规则
双水相萃取.doc
实训1 双水相萃取相图的制作一、实训目的1. 学习双水相分离萃取的原理和方法2. 学习双水相萃取相图的制作二、实训原理双水相萃取法是利用物质在互不相容的两个水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
两水相的形成：高聚物与无机盐在水中由于盐析的作用会形成两个相，如PEG 与硫酸盐或碱性磷酸盐。
两种亲水性高聚物在水中由于聚合物的不相容性也会形成两个相。
但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相，双水相形成的定量关系可用相图来表示。
相图是一根双节线, 把均匀区和两相区分隔开来。
当成相组分的配比取在：线的下方时，为均相区； 曲线的上方时，为两相区；在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。
相图中TMB 称为系线；T 代表上相组成；B 代表下相组成；同一条系线上各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。
V T / V B = BM / MT三、实训器材、试剂、材料1.器材：试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管。
2.试剂：聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵。
四、实训操作步骤1.PEG2000（NH 4)2SO 4双水相体系相图的测定（1）取10%（g/ mL ）PEG2000溶液10mL 于三角瓶中。
（2）用40%（g/mL ）（NH 4)2SO 4溶液装入滴定管中滴定至三角并中溶液出现浑浊，记录）NH4)2SO 4溶液消耗的体积。
加入1mL 水使溶液澄清，继续用（NH 4)2SO 4溶液滴定至浑浊，重复7～8次，记录每次（NH 4)2SO 4溶液消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG2000和（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）。
（3） 以（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）为横坐标，PEG2000的浓度（g/mL ）为纵坐标，绘制PEG2000- （NH 4)2SO 4双水相体系相图。
2. 相图制作表10%PEG2000 10mL 温度T=20℃次H 2O 加量(NH 4)2SO 4纯(NH 4)2SO 4溶液累PEG2000(NH 4)2SO 4PEG2000 %(NH 4)2SO 4 %两相 均相数(mL) 溶液加量累计量（g）计总量(mL)(%) (%)(mL) （g）1 12 13 14 15 16 17 18 1五、结果与讨论1.如何正确绘制相图。
生物分离-双水相萃取实验指导
双水相萃取相图的绘制1．实验目的⑴掌握绘制双水相相图的方法⑵理解双水相形成条件和定量关系2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。
成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。
直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。
所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（V T/V B）不同。
相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。
本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
图1 双水相体系相图3．实验材料及仪器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。
4．实验方法准确称取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。
以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
5．数据处理表1 相图节点数据序号PEG质量（g）体系中盐溶液（mL）盐质量（g）体系加水量（g）体系总质量（g）PEG质量分数（w/w）盐质量分数（w/w）1 02 0.33 0.5……………………n 1.5双水相萃取牛血清白蛋白1．实验目的⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
2013PEG400(NH4)2SO4两水相系统的相图2012共17页
器材： 50ml试管、25ml滴定管、台秤、旋涡混合器、
移液枪或移液管
四、操作方法
（一）溶液配制（已配制）
配制43%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称适量 硫酸胺
少量水 溶解
稀释
密度 1.2g/ml
密度计 测密度
（二）相图的制作（浊点法）
上课前： 各班负责人分发好实验报告。
PEG400/(NH4)2SO4 两水相系统的相图
指导教师：龚小雁 张秀萍
一、实验目的和要求
了解制作两水相系统相图的方法。 加深对相图的认识。
二、实验原理
两水相系统： 萃取分离。 两种亲水性高聚物或高聚物与盐类的水溶液相互混
合时，达到一定浓度后形成互不相溶的两相。
说明已接近浊点，之后要缓慢逐滴滴加(NH4)2SO4溶液。
五、思考题
（Байду номын сангаас）预习
1. 简述两水相萃取中成相的原因。 2. 说明实验数据的每步计算方法。
（二）实验结果和讨论
1. 将实验结果列入表格，并作出相图。 2. 实验操作中应注意哪些问题？分析实验误差。
讲课结束后，清洗下周实验所需器皿： 每组准备好两根干净干燥的大试管（50ml）。 10ml刻度离心管1根 14根10ml试管 清洗好后倒扣放入金属篓筐内。
3 0.3
纯(NH4)2SO4累计量m’(g)=43%* V盐
4 0.3
溶液累计总量m总(g)=mPEG+m盐+水的累计加量
5 0.5
PEG400(%)=mPEG/ m总
PEG400 (NH4)2SO4
(%)
(%)
实验二双水相萃取α淀粉酶分配平衡(精)
实验二双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求1掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。
2了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。
3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸铵体系双水相萃取实验操作。
4明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。
二、实验器材和试剂1. 实验器材 :低速离心机;酸度计;涡流混合器;分光光度计2. 实验试剂 :PEG :(分子量分别为 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸铵、α-淀粉酶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛,最常采用的双水相体系是 PEG/Dex 或 PEG/低分子盐系统, 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。
T 为上相浓度, B 为下相浓度 , C 为系统临界点, TCB 为临界线或双节线,双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。
因此两相浓度要足够高才可以形成两相。
双水相萃取分配系数 K=Ct /Cb ,为上相和下相的浓度比。
双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。
利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。
相图中 TMB 为系线,其长度由相组成的总浓度决定,表征两相差异程度。
在临界点附近系线长度趋近于零,表示上相和下相的组成相同,因此分配系数应为 1。
随着 PEG 、硫酸铵和盐浓度增大,系线长度增加,上相和下相相对组成的差别就增加,酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。
本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配,具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。
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实验二PEG/磷酸盐双水相体系相图的绘制及萃取分配平衡实验
一、实验目的
1．掌握双水相相图的制作方法。
2．掌握双水相萃取过程中分配系数的测定。
二、实验原理
常用的形成双水相系统的成相组分有可由两种高聚物，或一种高聚物和一种无机盐。
高聚物与高聚物形成两相的原因是高聚物的不相容性，高聚物与盐形成两相的原因是无机盐的盐析作用。
两水相的成相条件和定量关系，用相图表示，
α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。
三、仪器和药品
PEG （1000，2000， 4000， 6000），NaH2PO4，K2HPO4•12H2O，NaCl，柠檬酸，碘，碘化钾各，α-淀粉酶。
分光光度计，离心机，恒温水浴锅（温度计），量筒，烧杯，移液管，试管，试管架，试剂瓶。
四、实验步骤
20 g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉（以绝干计）2.00 g，精确至0.001 g，用水调成浆状物，搅动下缓缓倾入70 mL沸水中，然后以30 mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100 mL，此溶液需要当天配制。
1. 将一种分子量的40%的PEG 和无机盐母液制成一定浓度原液：准确量取5 mL的一种PEG 原液加入到50 mL或100 mL的量筒中，称重。
用移液管不断加入无机盐原液，混合，直至试管开始出现混浊并分层为止，称重，计算加入无机盐的量，算出PEG 和无机盐在系统中的重量百分浓度，再加入适量水（1～5 mL），使体系澄清，计量加入的水，并继续加入无机盐，使系统再次变混浊并分层为止，如此反复操作。
计算达到混浊时PEG 和无机盐在系统中的重量百分含量，以磷酸盐浓度为横坐标、PEG浓度为纵坐标，绘出PEG和磷酸盐的双节线相图。
2. 双水相萃取分配平衡实验
根据相图在分层临界点处，按照相应的PEG无机盐和水（含有相应的酶）的体积比配制两相，等待静置分层分别得到两相的体积，并测定酶活力，求出K值：
K＝C上相酶活/ C下相酶活
称取α-淀粉酶，精确至0.0002 g，加水稀释，过滤，取澄清滤液供测定用。
实验用的瓶装的酶活大概在4000 U/g 左右，最后在分光光度计中测定的酶活力应在3.7-5.6 U/mL范围内。
3. α-淀粉酶活性的测定方法
定义：于60℃、pH=6.0条件下，1小时液化1g可溶性淀粉，所需的酶量规定为1个酶活力单位，酶浓度以U/g（U/mL）表示。
测定：吸取20.00 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入5.00 mL缓冲液摇匀后，于60±0.2℃恒温水浴中预热5 min。
加入稀释好的待测酶液1.00 mL，立刻计时，摇匀，准确反应5min。
立即吸取1.00 mL反应液于5.00 mL稀碘液中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660 nm波长下，用10 mm 比色皿，迅速测定其吸光度（A），根据其吸光度查表，求得测试酶液的浓度（c U/mL）。
吸光度（A）与测试酶液浓度（c）对照表：
计算：X＝c×n
式中：X—样品的酶活力，U/g（U/mL）；c—测试酶液的浓度，U/mL；n—样品的稀释倍数。
所得的结果表示至整数。
平行试验相对误差不得超过2%。
五、实验结果整理
①绘出一种PEG/磷酸盐的双节线相图。
②求出α-淀粉酶在一种PEG/磷酸盐体系中的分配系数
表1 吸光度（A）与测试酶液浓度（c）对照表
A c A c A c A c A c
0.100 4.694 0.235 4.074 0.370 3.665 0.505 3.324 0.640 3.068 0.105 4.669 0.240 4.056 0.375 3.651 0.510 3.313 0.645 3.060 0.110 4.644 0.245 4.037 0.380 3.637 0.515 3.302 0.650 3.052 0.115 4.619 0.250 4.019 0.385 3.623 0.520 3.291 0.655 3.045 0.120 4.594 0.255 4.002 0.390 3.610 0.525 3.280 0.660 3.037 0.125 4.569 0.260 3.984 0.395 3.596 0.530 3.270 0.665 3.030 0.130 4.544 0.265 3.968 0.400 3.583 0.535 3.260 0.670 3.022 0.135 4.518 0.270 3.951 0.405 3.569 0.540 3.249 0.675 3.015 0.140 4.492 0.275 3.935 0.410 3.554 0.545 3.239 0.680 3.008 0.145 4.467 0.280 3.919 0.415 3.541 0.550 3.229 0.685 3.001 0.150 4.442 0.285 3.915 0.420 3.528 0.555 3.219 0.690 2.994 0.155 4.418 0.290 3.900 0.425 3.515 0.560 3.209 0.695 2.998 0.160 4.394 0.295 3.885 0.430 3.502 0.565 3.200 0.700 2.981 0.165 4.370 0.300 3.869 0.435 3.485 0.570 3.190 0.705 2.975 0.170 4.347 0.305 3.854 0.440 3.477 0.575 3.181 0.710 2.968 0.175 4.324 0.310 3.839 0.445 3.464 0.580 3.171 0.715 2.962 0.180 4.301 0.315 3.824 0.450 3.452 0.585 3.162 0.720 2.956 0.185 4.279 0.320 3.809 0.455 3.440 0.590 3.153 0.725 2.950 0.190 4.257 0.325 3.794 0.460 3.427 0.595 3.144 0.730 2.944 0.195 4.235 0.330 3.779 0.465 3.415 0.600 3.135 0.735 2.938 0.200 4.214 0.335 3.765 0.470 3.404 0.605 3.126 0.740 2.932 0.205 4.193 0.340 3.750 0.475 3.392 0.610 3.118 0.745 2.927 0.210 4.172 0.345 3.736 0.480 3.380 0.615 3.109 0.750 2.921 0.215 4.152 0.350 3.721 0.485 3.369 0.620 3.101 0.755 2.916 0.220 4.132 0.355 3.707 0.490 3.357 0.625 3.094 0.760 2.911 0.225 4.112 0.360 3.693 0.495 3.346 0.630 3.084 0.765 2.905 0.230 4.093 0.365 3.679 0.500 3.335 0.635 3.076。