两虫检测方法说明
出口蔬菜中杀虫双残留量检验方法
出口蔬菜中杀虫双残留量检验方法1.适用范围本方法适用于出口青菜中杀虫双残留量的检验。
2.原理概要用稀盐酸溶液提取试样中的杀虫双，在碱性条件下，以硫化钠作催化剂，使杀虫双转化为沙蚕毒素，然后用乙酸乙酯提取，液一液分配净化以后，用配有电子俘获检测器的气相色谱仪进行测定，外标法定量。
3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂无水硫酸钠：分析纯，经650℃灼烧4h以上，置于干燥器内备用；乙酸乙酯：分析纯，经全玻璃系统重蒸馏；助滤剂：硅藻土(celite)545；盐酸：分析纯，配成0.1mol/L，2mol/L水溶液；氢氧化钠：分析纯，配成2mol/L，10mol/L水溶液；硫化钠：分析纯，配成0.2mol/L水溶液；杀虫双标准品：纯度≥99%；杀虫双标准溶液：准确称取杀虫双标准品，以蒸馏水配成0.1mg/mL的标准贮备液，用时根据需要用蒸馏水稀释至适当浓度的标准工作溶液。
3.2.仪器气相色谱仪：配备电子俘获检测器；微量注射器：1μL、10μL；高速组织捣碎机：配有捣碎杯；全玻璃系统蒸馏装置；分液漏斗：50mL、125mL；平底漏斗：9cm(内径)；抽滤瓶：500mL；刻度试管：具磨口塞，10mL。
4.试样的抽取与制备4.1.检验批以不超过1000件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。
4.2.抽样数量批量，件最低抽样数，件1～25 126～100 5101～250 10251～1000 154.3.抽样方法按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。
每件至少取500g作为原始样品，其总量不少于2kg，放入洁净容器内，加封，标明标记，及时送交实验室。
4.4.试样制备从原始样品中取可食部分，用四分法缩分出不少于500g样品放入组织捣碎机中捣碎、混匀，均分成两份试样，装入洁净容器中，加封，标明标记。
4.5.试样保存将试样于－18℃以下冷冻保存。
注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
饮用水水质标准中增加“两虫”检测的意义
论饮用水水质标准中增加“两虫”检测的意义摘要贾第鞭毛虫与隐孢子虫（简称“两虫”）是两种严重危害饮用水水质安全的病原微生物。
“两虫”具有个体微小，致病量低、感染途径和方式简单,流行分布广泛的特点。
人感染后出现呕吐、腹泻等症状，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于人体自身的抵抗力。
目前水源性感染是其最大的感染源。
城市供水系统中的“两虫”直接威胁饮用水安全,并同时对城市水环境带来生态和健康风险。
在饮用水水质标准中增加“两虫”项目，可有效控制“两虫”病的传播，保障饮用水饮用水安全。
关键词贾第鞭毛虫；隐孢子虫；饮用水水质标准由供水系统污染所引起的水传播疾病时有暴发，对人类的健康构成直接威胁，不但对社会造成了巨大的经济损失，而且容易造成人们对供水系统安全性的质疑及恐慌。
而贾第鞭毛虫和隐孢子虫被认为是世界上最主要的导致人体腹泻的水源性原生动物寄生虫。
近年来，以饮用水为媒介引起的隐孢子虫病和贾第鞭毛虫病不断暴发，对饮用水安全构成严重威胁，对城市水环境带来生态和健康风险，已引起了包括我国在内的世界各国的关注。
美国疾病预防控制中心于1996年、2002年分别将隐孢子虫感染和贾第鞭毛虫感染列入国家必须申报的传染病名单。
我国也在2006年将“两虫”检测加入饮用水水质标准，规定每10L小于1个孢囊或卵囊[1]。
随着城市化进程的发展，城乡生活垃圾、生活污水和养殖业污水排放量迅速增加，部分人、畜、禽粪尿污染环境和水源，“两虫”感染介水传播的危险性亦随之增加。
因此积极开展净水工艺的改进及隐孢子虫和贾第鞭毛虫的控制技术，对于疾病控制的流行和发展、保证饮食安全、保障人民的健康等都具有重要的意义。
1贾第鞭毛虫和隐孢子虫的危害1.1生物学性质1.1.1贾第鞭毛虫蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia Lamblia Stiles,1915）简称贾第鞭毛虫，是一种寄生于人类和动物肠道的原生动物。
在人体中时，寄生于人体小肠、胆囊，主要于十二指肠，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状，为人体肠道感染的常见寄生虫之一。
两虫概述
两虫”（隐孢子虫和贾第鞭毛虫）检测系统产品简介我公司推荐使用的Envirochek “两虫”检测方法是GB5749-2006国标和GB/T5750-2006《生活饮用水标准检验方法》测定生活饮用水和水源水中“两虫”的首选方法，也是GB/T5750-2006国标规定的两虫检测的仲裁法，同时也是美国EPA1623测定两虫的标准方法，是专门检测水中“两虫”的实验方法。
（注：“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法。
）概括地说,该方法分为三部。
第一，对水样进行过滤,收集水中的卵囊和孢囊；第二，利用免疫磁分离来纯化过滤样品；第三，对纯化的样品通过免疫荧光显微镜法来检测“两虫”的数量详细介绍1水样过滤采用美国EPA推荐的PALL公司Envirochek-HV囊式滤器对水样进行过滤，将卵囊、孢囊及其他物质收集在过滤器上。
该过滤器可用于实验室批量水样的过滤，也可以用于野外现场水样的过滤。
Envirochek囊式滤器特点及优点：EPA 1622 & 1623方法推荐首选产品，配合“多臂”洗脱震荡器，实现多样品检测，大大节省人力和时间。
1um孔径的改良滤膜能100%截留两虫,专用于源水（>50升）与自来水（>1000升）的两虫浓缩与回收。
一次性使用的一对一设计避免了污染而造成的实验结果误差。
简单的安装与拆卸省时省物，并且可以现场采样、异地检测。
2免疫磁分离IMS{Immuo Magnetic Separation}将离心后含有卵囊和孢囊的沉淀物用纯水混匀，并向其中加入免疫磁分离试剂进行磁分离。
其原理是：利用带有特异性抗体的磁珠与样品中的目标产物特异性抗原相结合，在磁场中高效选择性分离。
3 IFA 染色 & 镜检：将卵囊和孢囊在井形载玻片上用磁荧光标记的单性抗体和DAPI溶液着色后，用正置荧光和差分干涉相衬（DIC）显微镜对着色样本进行检测。
两虫检测方法说明
两虫检测方法说明一、虫情监测虫情监测是指通过设置虫情监测网、黄板、黄棒、诱捕灯等虫情监测器具，对田间作物中的害虫进行连续观察和记录，以获取害虫的信息，及时判断害虫的种类、密度和分布情况，为制定合理防控策略提供科学依据。
1.虫情监测网虫情监测网是由特定材料制成的具有较小网眼的网，可用于捕捉田间的害虫。
将虫情监测网张贴在农田中，通过害虫在网上活动时被捕捉，即可初步了解害虫的种类和数量。
根据该方法的监测结果，可以初步判断害虫发生的严重程度。
2.黄板、黄棒黄板、黄棒是一种颜色为黄色的卡片，涂有黏脂，可以诱捕害虫。
将黄板、黄棒张贴在农田中，害虫被卡片上的黏脂粘住，可以直接观察到害虫种类和数量。
常见的害虫如福寿螺、食蚜蝇等对黄色敏感，容易被黄板、黄棒吸引。
3.诱捕灯诱捕灯是一种利用光线特性吸引害虫的方法。
将诱捕灯设置在农田附近，利用灯光吸引害虫飞往灯光的特性，通过设定特定的高度和时间，将害虫吸引至灯光附近，然后通过捕捉器具进行捕捉和监测。
这种方法适用于一些飞行能力较强的害虫，如蛾类、夜蛾等。
二、害虫指标检测害虫指标检测是指通过采集农田中的农作物和虫体样本，使用特定检测方法对害虫进行分析，并通过结果判断害虫的发生情况和危害程度。
1.虫体采集虫体采集是害虫指标检测的第一步，可以通过人工采集、摄像机摄录等方式获取农田中的害虫信息。
针对不同类型的害虫，可以选择不同的采集方式和工具，如夜蛾可以在夜间使用灯光捕捉，福寿螺可以用笼子和饲料引诱。
2.害虫种类鉴定害虫种类鉴定是通过观察和比对采集到的害虫的外形特征，确定害虫种类的方法。
可以使用显微镜、专业的鉴定手册和数据库等工具进行鉴定。
通过识别害虫种类，可以了解其生物特性和危害程度，从而制定相应的防治策略。
3.害虫密度测定害虫密度测定是通过计数单位面积内害虫的数量，以便了解害虫种群数量和密度的方法。
可以使用虫体标本、摄像机采集的图像或者特定的统计设备进行准确计数。
根据害虫密度的测定结果，可以判断害虫对农作物的威胁程度，并制定具体的防治策略。
两虫资料
1 水中“两虫”检测方法概述浓缩→ 分离/纯化→染色 →检测2 镜检——不同模式下检查“两虫”450nm-480nm 蓝色滤光片，330nm-385nm 紫外滤光片。
FITC 模式下，单克隆荧光抗体与隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的表面蛋白相结合，蓝色激发光下发出绿色荧光；DAPI 与卵囊/包囊内的DNA 相结合，在紫外激发光下能看到卵囊/包囊的蓝色细胞核； 微分干涉DIC 模式下，能够看到卵囊和包囊的内部结构，从而进一步确认。
贾第虫：包囊呈椭圆形，直径8-15 µm ，宽5-8 µm ，在荧光显微镜蓝光激发下包囊壁发出苹果绿荧光；在紫外激发下，包囊内出现1-4个蓝色细胞核，在1000× DIC 能看到细胞核、中轴等内部结构。
隐孢子虫：卵囊呈圆形或椭圆形，直径4-6 µm ，在荧光显微镜蓝光激发下卵囊壁发出苹果绿色荧光；在紫外激发下，卵囊内出现1-4个蓝色细胞核，在1000×DIC 能看到子孢子、残体等内部结构。
PBS 是磷酸缓冲液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释，原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH 缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH 的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS 是首选。
PBS 也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS 还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。
pbs 缓冲液PBS 缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。
含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS －T)配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。
北京培训中心—两虫全流程
• 可采取虹吸，弃去上清。管子上插上枪头，使得震 动最小。
如何提高回收率
谨慎清洗玻片
• 隐孢子虫和贾第虫可能在染色过程被冲走，为了避 免此情况发生，请轻轻的移走玻片上的液体。
如何提高回收率
玻片干燥过程可影响回收率 • IMS过程中的酸如果没有有效中和可以破坏贾第虫的 孢囊外表，引起贾第虫染色过程中的变化。这可以导 致镜检过程中贾第虫的漏检。快速将样品干燥以及冷 藏样品可以保证贾第虫的表面不受损坏 。 • 为了优化此步骤，确保样品一旦中和后，快速在37℃ 条件下干燥（最长干燥时间1小时），并立即染色。 • 如果IMS中和后需要延迟染色，需要快速在37℃干燥 玻片后立即放入冰箱冷藏过夜。否则，需要在标准的 家用冰箱冷藏过夜。在冷室中干燥玻片可能由于湿度 环境使得玻片不易干燥。
样品预处理——过滤
实验室过滤
样品预处理——过滤
现场过滤
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱 滤器 滤芯 采样管 水表 保温袋 自封袋
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱 • 根据客户需要合理设计的取样箱。 • 解决现场采样问题，并使得现场采样操作简便。 • 解决部分无两虫检测设备的送样问题。
如何提高回收率
免疫磁分离
• 对于一些水样，很大一部分的隐孢子虫和贾第虫可能会遗漏 在IMS磁珠上，在酸化过程中没有得到回收。此时进行二次 酸化可以有效提高回收率。IMS分离过程中，二次酸化分离 非常有用。 • 对于回收率比较低没有满足回收率标准的样品，可以将其 IMS过程废弃的上清液进行收集，对这些废液再次进行免疫 磁分离过程，以满足回收率。可以将废液收集到免疫磁分离 之前用的 50mL的离心管中，这可以避免错误的标记样品， 你可以分辨哪个样品具有较低的回收率然后做一个二次的免 疫磁分离。非常多的干扰免疫磁分离的物质在第一次免疫磁 分离过程中都被去除掉了，所以第二轮免疫磁分离回收率可 能会戏剧性的更高。
两虫检测方法说明
隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明一、标准接种吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。
将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。
链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。
（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）二、样品的淘洗和浓缩1.准备缓冲液在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。
需要准备400ml纯水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml 缓冲液。
PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。
调PH值到7.4。
加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。
（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2.转移到缓冲液瓶中缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。
3.初始化的系统检测在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。
a.将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初始化系统检测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）b.完成样品淘洗过程的1-8步。
c.在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。
d.把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。
e.用70%的酒精擦洗QC干体。
f.进行正式的样品淘洗。
4.淘洗样品a.打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关——空气压力阀，关：空气压力阀——电源开关）打开空气压力泵。
绿色的灯（显示电源）和红色的灯（显示设备处于准备状态）会亮。
b.把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架上。
提高饮用水“两虫”检测回收率的方法探讨——Filta-Max xpress快速法
T echno logy科技科技文苑
隐孢子虫和贾第鞭毛虫（简称“两虫”）是严重危害水质安全的病原性原生动物，由于其对于通常的氯消毒过程具有较强抗性，因此《生活饮用水卫生标准》（ＧＢ ５７４９－２００６）中首次将“两虫”检测项目列入其中。
由于方法的特殊性，标准中规定两虫检测回收率合格标准最低仅为１０％。
为掌握检测要点，切实提高检测技能，对“两虫”检测过程中的关键步骤进行分步加标回收率测试，对影响回收洗、酸化分离步骤的分步回收情况进
行测试。
①用高浊度水样（环城河水、活
性炭混悬液）代替洗脱液测定Ｈｅｔｔｉｃｈ
Ｒｏｔａｎｔａ ４６０离心机离心效果，并对离
心后抽取的上清液进行二次离心。
②
将Ｇ－Ｃ质控样直接加入到装有４５０ ｍＬ
淘洗缓冲液的离心管中进行加标回收
率的测定。
③对加标水样的过滤模块
连续淘洗两次，分别测定两次淘洗的
回收率。
④测定免疫磁分离阶段加酸
能放在离心管的中心部位，不应贴到
管壁上。
图3 蓝色滤光片图4 紫外滤光片。
USEPA1623“两虫”检测设备招标参数
“两虫”检测设备技术参数设备总体要求：该检测设备用于对各类样品中隐孢子虫和贾第虫的分析。
包括捕获富集，净化和显微镜检测装置等。
以上仪器及其配套件（包括备件、特殊工具等）的货物包括供应、安装、调试、售后服务等相关服务。
投标商的投标产品应为国内销售量较多的型号产品。
工作环境要求：⑴环境温度5-40℃⑵电源供给220V±10%（AC），50HZ⑶相对湿度5%-95%技术要求：⑴捕获富集系统：一次性囊式滤器避免较差污染；（回收率稳定高于70%--90%以上）⑵富集系统相关标准偏差（RSD）：8—14%⑶处理样品量：处理水≤1000升，原水≤50升⑷样品流速：3—4升/分钟⑸过滤模块耐受压力：30PSI （120Pa）⑹净化方法：离心分离centrifugation/density gradient⑺检测方法：显微镜法⑻洗脱震荡器：可同时自动洗脱8个滤囊器。
售后服务要求：⑴厂家在国内应有良好的业绩和服务，在国内拥有广泛的用户。
⑵免费培训。
卖方应保证在国内有专门的定期培训基地，免费赠送详细的中文培训手册，卖方保证在国内有另备件保税仓库，保证今后部件的及时供应。
⑶到货后，在接到客户的调试要求后2周内完成调试服务，如果在2个月内调试未能完成，并影响使用性能，则退货并赔偿相关的经济损失。
⑷保修期：自仪器安装调试验收合格起1年。
保修期后，卖方应保证长期提供零备件和优质维修服务。
检测设备配置要求：一、采样过滤系统㈠采样过滤设备⑴囊式滤器（可以过滤源水和自来水），1微米的膜孔保证100﹪截留两虫和100﹪的完整性检测。
滤膜和膜孔的特殊结构可以保证洗脱回收率稳定高于70%--90%以上。
滤器一次性使用可以避免交叉污染，避免产生假阳性，可以过滤高浊度源水，可以进行现场采样过滤，是国标的首选仲裁法推荐产品。
滤器回收率稳定，水头损失小，标准偏差小，实验结果稳定，安装简便，免拆洗，节省时间和人力。
⑵洗脱振荡器：220V±10%（AC），50HZ，可同时自动洗脱8个滤器，900转/分钟振荡，洗脱彻底，保证洗脱回收率。
生活饮用水标准检验方法-微生物指标[1]
![生活饮用水标准检验方法-微生物指标[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/6ddc49a9daef5ef7ba0d3c6c.png)
Giardia
贾第鞭毛虫
两虫感染的特点 贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium) / 感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素 无效，治疗依赖于自身抵抗力 大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大 部分地下水都有被地表水污染的潜在危险 可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已 成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化 消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能 完全去除 饮用水高温煮沸也并非有效 对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高
修订后
微生物指标 限值 微生物指标
限值
-
肠球菌/（CFU/100mL）
0
-
产气荚膜梭状芽胞杆/（CFU/100mL）
0
一、菌落总数
修订前
修订后
细菌总数
菌落总数
原理：细菌总数是指水样在一定 定义：水样在营养琼脂上有氧条 条件下培养后（培养基成分、培 件下37℃培养48h后，所得1ml水 养温度和时间、pH、需氧性质等） 样所含菌落的总数。 所得1ml水样所含菌落的总数。按 本规范规定所得结果只包括一群
过滤器
滤芯
FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯
Filta-Max : 滤芯结构（手动/自动法）
60 层环状海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)
从60cm 压缩成 3cm 螺栓固定
Filta-Max xpress:快速法滤芯结构
40 层海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔) 39层海绵: 40mm x 10mm (18mm中孔) 交互叠放 从79cm 压缩到 3cm 螺栓固定
两虫仪器操作步骤
两虫仪器操作步骤需要配置的试剂:I.NaOH溶液：6.0M100ml：24g+100ml水（调节PH时用，少量即可）1.0M100ml：4.04g+100ml水（最终需要浓度，单位可先准备）2.HCL溶液：6.0M100ml：50ml+水定容至100ml（调节PH时用，10ml 即可，单位可先准备）1.0M100ml：8.3ml+水定容至100ml0.1M100ml：10ml1.0MHCL溶液+水定容至100ml（最终需要浓度，单位可先准备）ureth-12溶液（10%）：10g加热溶解90ml水中，冷藏：或者1g溶于10ml水中，现用。
Laureth是蜡状固体，所以称量时要直接用烧杯称量，注意不要弄到烧杯壁上。
溶解时会由月光白变透明，但依然未溶解，此时需要继续搅拌，知道溶解为止，溶解过程不需要加热都可以。
（Laureth是类似于肥皂的物质，溶解过程会由泡沫）。
室温下保存2个月或冷冻保存1年。
4.Tris溶液（1M，PH7.4）：12.11Tris+70ml水，调节PH7.4±0.1,定容100ml，用孔径2.1um的滤膜将它过滤灭菌后，移到一个无菌的塑料容器中，室温条件下储存6个月。
实验时也可取1.211Tris试剂于10ml水中（配制1L洗脱缓冲溶液只需10ml），用浓盐酸调节PH到7.4。
5.EDTA溶液（0.5乂，PH8.0）：18.61£口丁人（含结晶水）+80ml水，调节PH8.0±0.1,定容100mL室温下储存6个月。
实验时也可取1.861EDTA于10ml 水中（配制1L洗脱缓冲溶液只需2ml）,虚假热，溶解后尽快用40%氢氧化钠调节PH到8.0。
6.洗脱缓冲液：10mlLaureth-12溶液（10%）+10mlTris溶液（1M，PH7.4）+2mlEDTA溶液（0.5M，PH8.0）+150ulAntifoam（消泡剂）定容至1000ml （由于较难吸收，量取消泡剂时要慢慢放开移液枪，完全放开后要慢慢停留，压力会把消泡剂吸上来），室温条件下储存1个月。
浅谈水环境中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测方法
浅谈水环境中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测方法【摘要】水环境中微生物贾第鞭毛虫和隐孢子虫是两种严重危害水质安全的致病性原生寄生虫，主要通过水和食物等传播疾病，人和动物感染“两虫”所患疾病分别称为贾第鞭毛虫病和隐孢子虫病。
当前，人们逐渐认识到其对人类的危害不容忽视。
因此研究适合我国广大供水企业采用可靠的“两虫”检测方法极其重要，对保障我国城市供水水质安全具有重要的意义。
现就“两虫”在水环境中的检测方法予以综述。
【关键词】隐孢子虫；贾第鞭毛虫；检测一、隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的改进方法传统方法在使用过程中逐渐暴露出检出率低、重现率差、过程复杂、成本昂贵等缺陷，笔者通过工作实践开始在各个步骤予以改进，摸索出各种优化方案。
（一）样品前处理优化对传统方法中的样品处理过程进行改进，方案如下：采样一膜过滤一刮擦一隔夜浸泡一漩涡振荡一2次摇床洗脱一离心浓缩一洗涤沉淀一再次离心浓缩一IMS（2次酸解离）一IFA镜检读数。
该方法改进之处如下：1.直接在洗脱基础上，增加了滤膜刮擦后隔夜浸泡和洗脱前剧烈振荡，提高回收率，且使回收率更稳定；2.更换洗脱液，投加高岭土浊液，提高水样浊度至4NTU；3.离心浓缩后洗涤沉淀2次酸解离。
通过以上改进步骤，缩短了反应混合时间，减少了两虫与磁珠结合体解离，最大限度保留两虫在终检物中的存在水平，使检测结果尽可能接近实际。
（二）方法联用传统方法重现率差，关键限制步骤在漂浮处理，沉淀分离法重现率高于蔗糖漂浮分离法。
通过沉降法与免疫磁分离法联用，改进浓缩步骤，提高了重现率。
沉降法与免疫磁分离法联用重现率可达38.9%～58.5%，高于蔗糖漂浮法（重现率为1.3%～5.4%）。
且卵囊（包囊）预先染色允许精确估计峰浓度等于或低于背景水平的重现率，重现率在一定范围的生物固体中稳定，不受贮存保留时间的影响。
（三）改进检测设备及检测步骤目前，已知的1622和1623方法检测系统主要有：a.Cartridge方法、b.Envirochek浓缩法、c.Filta-Max系统。
两虫方法确认材料
两虫方法确认材料生活饮用水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的测定免疫磁分离荧光抗体法测定方法验证报告（GB/T 5750.12-2006）1.目的通过能力确认，确认实验室检出限、回收率，方法重复性方面是否都达到标准要求，实验室是否具备开展用免疫磁分离荧光抗体检测定生活饮用水及水源水的贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测能力。
2.适用范围本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及水源水中的贾第鞭毛虫和隐孢子虫（以下简称为“两虫”）的含量。
本标准适用于生活饮用水及水源水中的“两虫”的测定。
3.职责3.1 检测人员负责按操作规程操作，确保测量过程正常进行，消除各种可能影响试验结果的意外因素。
3.2复核人员负责检查原始记录。
3.3技术负责人负责审核检测结果。
4.测试方法4.1 术语和定义贾第鞭毛虫（Giardia）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫。
有两个种，宿主是：G.intestinalis（人类）和G.muris （鼠类）。
隐孢子虫（cryptosporidium）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，有6个种哺乳类动物，包括人类；鸟类；鼠类；爬行类和鱼类。
4.2．试剂4.2.1 Easy seed G/C质控标样（贾第鞭毛虫孢囊100±1.6，隐孢子虫卵囊100±1.2）；4.2.2 挪威Dynal贾第鞭毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒；4.2.3 美国Waterborne贾第鞭毛虫/隐孢子虫染色试剂盒；4.2.4 PBS缓冲溶液：NaCl，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.24g；纯水，1000mL，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2±0.1，在4℃可存储1个星期。
4.2.5 PBST淘洗缓冲液：NaCl，8g；，KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.2g；TWeen-20，0.1mL；纯水1000mL，将磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠加入到900mL超纯水，搅拌20min 至完全溶解，加入0.1mLTween-20并继续搅拌10min，然后用超纯水稀释至1000mL；4.2.6 0.1mol/LHCl；4.2.7 1mol/LNaOH；4.2.8 去离子水4.3器材Dynal MPC-1 磁极、Dynal MPC-S 磁极、Dynal MX1 混合器、FM xpressV2.0快速淘洗装置系统、蠕动泵、IKA涡旋震荡混混合器、空气压缩机、四川蜀科离心机、Dynal L10 试管、BK-FL正置荧光显微镜、移液枪。
两虫检测标准
两虫检测标准1. 目的本标准旨在规定两虫检测的流程、方法、数据分析以及质量保证等方面的要求，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2. 定义两虫检测是指对两种昆虫（虫1和虫2）进行检测的过程。
3. 检测范围本标准适用于对两种昆虫的检测，包括但不限于虫1和虫2。
4. 检测方法4.1 采集粪便样本采集粪便样本时应选择无污染的区域，使用一次性手套和采集工具，避免交叉污染。
样本大小为20-30克，尽量在清晨或空腹时采集。
4.2 样本前处理将采集的粪便样本进行筛选、清洗和粉碎，以去除杂质和大型杂质。
将处理后的样本放入离心管中，加入适量的生理盐水，充分搅拌均匀。
4.3 显微镜检查将样本溶液进行离心处理，弃去上清液，留下沉淀物。
将沉淀物涂片或制片，在显微镜下观察虫卵、幼虫或成虫。
根据虫卵的特征和数量进行诊断和计数。
4.4 免疫学检测采用免疫学方法（如ELISA、免疫荧光等）对样本进行处理和检测，以确定是否存在目标昆虫的特异性抗体。
根据试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线判断阳性或阴性结果。
4.5 结果分析根据显微镜检查和免疫学检测的结果进行分析，计算阳性率和感染率等指标。
对异常结果进行核实和修正。
5. 检测流程5.1 采集粪便样本按照4.1所述方法采集粪便样本。
注意避免交叉污染和样品混淆。
5.2 样本前处理按照4.2所述方法对样本进行处理，去除杂质和大型杂质，得到纯净的粪便样本。
这一步可以提高显微镜检查的准确性和可靠性。
6. 数据分析6.1 阳性率计算显微镜检查和免疫学检测的阳性率，分析不同地区、年龄、性别等群体的感染情况。
阳性率是反映感染情况的重要指标之一。
通过对阳性率的分析可以了解感染状况和流行趋势，为制定防控措施提供依据。
6.2 年龄分布根据受检者的年龄段划分数据统计范围，分析各个年龄段的两虫感染情况。
年龄分布可以反映不同年龄人群的感染状况和易感性，有助于针对性地开展防治工作。
太原市城市供水两虫检测研究
文章编号：1009-6825（2013）25-0131-02太原市城市供水两虫检测研究收稿日期：2013-06-30作者简介：张敏（1979-），女，硕士，工程师张敏（太原市自来水公司水质管理处，山西太原030009）摘要：介绍了太原市城市供水的水源概况，采用免疫磁分离及荧光染色法对该市城市供水水源水和出厂水两虫进行了六年的连续检测，并对检测结果给予分析。
研究表明：太原市地下水源被两虫污染的风险极小；地表水源中有存在两虫的可能性，应做好源头防护和监控，同时控制地表水厂出厂水浊度。
关键词：两虫，免疫磁分离，荧光染色中图分类号：TU991．21文献标识码：A0引言2012年7月GB5749-2006生活饮用水卫生标准强制实施，微生物类指标由原来的两项增至六项，其中包括贾第鞭毛虫和隐孢子虫（以下简称“两虫”）。
两虫是两种致病性寄生虫，是引起人类腹泻的两种重要的病原体，二者在世界各地均有广泛流行。
以水为媒介和人际之间的相互接触是两虫感染人体的重要传播途径，因此城市供水中的两虫问题严重威胁着人们生活饮用水的安全性。
EPA1623法是国际上应用最广泛的两虫检测方法，目前我国绝大多数自来水公司均采用该方法检测两虫。
1太原市水质情况太原市城市供水水源分为地下水源和地表水源，其中地下水源有兰村、枣沟、三给地垒三个水源地，经长期检验，其水质完全符合GB/T14838-1993地下水质量标准，均为优质深层岩溶水。
其生产工艺是由水源地深井开采，经潜水泵提升，由输水管道进入水厂清水池，加氯消毒，经检验合格后进入城市管网。
地表水源从黄河万家寨水库取水，长距离输送到汾河水库后，再由汾河水库送入呼延水厂。
多年来，对万家寨和汾河水库的水质进行了监测，结果表明其水质符合GB3838-2002地面水环境质量标准中所规定的三类水水质标准，呼延水厂采用混凝、沉淀、过滤和消毒的净水工艺流程，将地表水净化为生活饮用水，进入城市管网，其供水水质达到国家GB5749-2006生活饮用水卫生标准。
2 害虫检测监测技术
一、储粮害虫（螨）监测方法
3、瓦楞纸板法诱捕粮库粮堆表层 储粮昆虫（螨）种类研究工作
瓦楞纸板法具位置布置
13个省份39个粮食仓储单位
上万个瓦楞纸板诱捕器
形态鉴定、分子鉴定技术
结论：瓦楞纸板诱捕器在粮库中粮堆表面能够诱捕到 储粮昆虫（螨）29种，其中主要有嗜虫书虱、锈赤扁 谷盗、赤拟谷盗、米象、谷蠹、麦蛾、米象小蜂等26 种储粮昆虫，同时诱捕到强壮肉食螨等3种螨类。
三种方法对同时诱集 到的储粮害虫数量基 本均呈粘虫色板法＞ 波纹纸板法＞取样筛 检法。其中粘虫色板 法诱集到的储粮害虫 数量远高于其它两种 方法，尤其书虱和扁 谷盗，比波纹纸板诱 捕器和取样筛检法均
大一个数量级。
一、储粮害虫（螨）监测方法
结论： 粘虫板诱捕器法和瓦楞纸板诱捕
法优于取样筛检法。
一、储粮害虫（螨）监测方法
小眼书虱 Liposcelis paeta Pearman
麦蛾科 Gelechiidae
麦蛾 Sitotroga cereatella Olivier
卷螟科 Phycitidae
印度谷螟 PLodia interpunctella Huebner
皮蠹科 Dermestidae 黑毛皮蠹 Attagenus unicolor japonicus Reitter
一、储粮害虫（螨）监测方法
2、储粮害虫（螨）监测 运用观察检查、取样检查、诱捕检查等方法
，系统、准确检查粮堆或环境内的粮害虫（螨） 发生数量，连续获取害虫（螨）种群相关信息， 得到全年发生规律，为预测储粮害虫（螨）发生 趋势、种群动态及潜在的危害提供基础数据，也 为治理储粮害虫（螨）提供决策依据。
广东
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两虫检测系统调查报告
"两虫"检测系统的调研报告一、隐孢子虫和贾第鞭毛虫介绍隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种能够感染人类和大多数养殖动物、宠物及野生动物的寄生性原虫，可导致世界范围内人和动物胃肠道疾病。
免疫力低下个体如老人，儿童以及艾滋病患者被感染后，可以引起慢性长期腹泻，腹痛，甚至可以威胁生命。
其传播途径主要是从动物到人以及人到人的直接传播，还包括通过食物和水的间接传播，其中尤其以介水传播最为严重，容易引起大规模的暴发流行。
迄今为止，世界各地都有隐孢子虫病或者贾第虫病暴发的报道。
二、必要性及需求分析隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛孢囊通过被感染的人或牲畜粪便排出体外，进入水循环系统。
大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的，地下水也有被地表水污染的潜在危险，“两虫”也可以通过被污染的源水而进入供水系统，水源性感染已成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯消毒有抗性，氯不能渗透过孢/卵囊，沙滤及膜过滤法也不能完全去除，而且饮用水高温煮沸也并非完全有效。
“两虫”感染患者轻则引起水样腹泻，呕吐，腹痛及类流感症状，重则危及生命。
目前尚无特效药，无预防疫苗，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于自身抵抗力。
全球最大有记录的隐孢子虫污染事件发生于1993美国威斯康辛州密尔沃基市，估计约有40万人因感染而引起腹泻，造成50死亡，2年后依然有因免疫系统受损死亡病例。
隐孢子虫及贾第鞭毛虫通过饮用水而感染人，一旦出现疾病爆发，将产生严重的社会和经济影响。
因此，饮用水及水源水中“两虫”的检测显得尤其重要和急需。
三、国外隐孢子虫/贾第氏鞭毛虫监控体系及检测方法两虫检测方法主要有：荧光免疫分析法（1623法）、酶联免疫法、PCR法。
虽然PCR 法及酶联免疫法的敏感性都比1623法好，但PCR法以及酶联免疫法所需的试剂比较昂贵、成本高、检测周期较长，且操作较为复杂，对实验人员的技术要求较强。
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隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明
一、标准接种
吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。
将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。
链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。
（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）
二、样品的淘洗和浓缩
1.准备缓冲液
在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。
需要准备400ml纯水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml 缓冲液。
PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。
调PH值到7.4。
加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。
（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2.转移到缓冲液瓶中
缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。
3.初始化的系统检测
在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。
a.将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初始化系统检
测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）
b.完成样品淘洗过程的1-8步。
c.在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。
d.把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。
e.用70%的酒精擦洗QC干体。
f.进行正式的样品淘洗。
4.淘洗样品
a.打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关——空气压力阀，关：空气压
力阀——电源开关）打开空气压力泵。
绿色的灯（显示电源）和红色的
灯（显示设备处于准备状态）会亮。
b.把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架
上。
c.把分流调节装置连接到滤器上的QF干体装置上。
d.滤器的上端向下，把分流调节器放在离心管上，这时会有水从分流调节
器中流到离心管中。
e.把滤器上的QC主体连接到两虫淘洗装置上的QC肢体上。
f.确保缓冲液已经放在缓冲瓶中了。
确保有插管的瓶盖盖到缓冲瓶上，且
密封环完好，并把瓶盖拧紧。
g.按控制面板上的F1键开始两虫淘洗过程。
h.淘洗过程结束后，把滤器从淘洗设备上取下，然后把出口分流调节器从
滤器上取下。
i.把滤芯从滤器中取出，并丢弃（通常经过高压处理后再弃掉）。
j.盖上离心管并从淘洗设备中取出。
k.用酒精清洗QC干体装置。
l.进行下一个样品淘洗。
m.用纯水代替缓冲液清洗残留在设备内部管路中的缓冲液。
如果超过一周不使用淘洗设备需将设备中的水排干，将瓶中的水倒掉，空抽一次。
5.离心浓缩及转移浓缩液
a.离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动。
b.平衡对称的离心管，和适配器、离心桶一起平衡，重量差别不超过0.5g，
尽量减少摆动。
注意：如果离心管不被平衡则会产生额外的震动，影响
到目标物的沉淀。
c.设置离心机参数2000g，15min。
样品在离心机中自然惯性停止，不可使
用刹车系统急停。
d.用真空泵或蠕动泵吸取离心管中的上清液，在进口处装一个移液枪头（如
5ml枪头）以减少进口的真空力度。
最终留取5-8ml（可预先在管上做好
标记）。
流速控制在200±20ml/min。
注意把移液管放到液面中心，接近
液面处上吸取上清液，以减少沉淀的损失。
e.将离心管中的剩余的浓缩液在涡旋混合器上混匀20秒。
f.用缓冲液润洗移液枪将所有液体转移至L型试管中。
（注意：移液枪头需要用缓冲液润洗下，是为了避免移液管壁因干燥而
将两虫挂壁。
）
g.使用纯水清洗两次移液管（如剩余体积为7ml,则每次1.5ml）,并将清洗
液移入同一个L型试管中，每次冲洗后都要我选20秒再移出液体。
三、两虫的捕获
★隐孢子虫/贾第鞭毛虫磁珠分选试剂盒：10XSL TM-BufferA，10XSL TM-BufferB,Dynabeads anti-Cryptosporidium—隐孢子虫磁珠，
Dynabeads anti—贾第鞭毛虫磁珠。
a.配制1XSL TM-BufferA溶液：向900ul蒸馏水加入100ul 10XSL TM-BufferA。
b.向L型试管内加入1ml的10XSL TM-BufferA（10XSL TM-BufferA在0-4℃
储存时可能会有结晶析出，使用前将其放置在室温下充分溶解）。
c.向L型试管内加入1ml的10XSL TM-BufferB。
d.将隐孢子虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。
e.将贾第鞭毛虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管
内。
f.盖上L型试管盖，将其放置在DYNAL MIX混合器上，室温下混匀孵育
1小时（这期间主要是磁珠对虫卵的捕获）。
g.孵育结束后，将L型试管移至DYNAL MPC-1磁极上，试管的平坦面朝
向磁极。
h.将磁极持续呈90度角转动2分钟。
i.打开试管盖将上清液缓缓倾倒出去（注意此时磁极和L型试管不可分离）。
j.将L型试管从磁极上取下，加入1ml的1XSL TM-BufferA与试管内磁珠混匀（注意：此时不要使用涡旋混合器，为了进行充分的清洗，可以将这
1ml试剂分成2-5次加入）。
k.将所有的液体和磁珠转移至1.5ml微型离心管（即EP管）内。
l.将EP管放置在DYNAL MPC-S磁极上。
m.将磁极持续呈180度角转动1分钟。
n.打开盖子，将上清液缓慢吸出，包括盖子上的液体也一并析出（此时磁板和磁极不可分离）。
o.将磁板从DYNAL MPC磁极上取下，并向EP管内添加50ul0.1N HCl，使用涡旋混合器混匀10秒钟。
p.将EP管在室温下放置10分钟，再涡旋混合10秒钟，将EP管插回到插有磁板的MPC-S磁极上，静置10秒钟，吸取上清液。
q.准备一个载玻片，向槽内添加5ul 1N NaOH。
将上述EP管内的溶液全部转移至凹槽内。
（此时不要从磁极上取下，转移过程中不要碰贴壁的磁珠）。
r.可以在室内自然干燥，准备进行染色。
s.如有需要可另取载玻片重复进行p—s步骤1-2次，以提高回收率。
四、隐孢子虫和贾第鞭毛虫荧光染色
★染色荧光试剂盒：Easy stain单克隆荧光抗体染色剂，fixing Buffer 洗脱染色液，DAPI核染色剂，mounting mediun封固剂，阳性对照物，
单孔载玻片。
a.当样品干燥完毕，下一步使用一滴甲醇进行固定（约50ul），静置若干分
钟至完全干燥。
b.向载玻片上加一滴Easy stain将这滴液体用玻璃棒引它覆盖于整个井形凹
槽，但是千万不要碰到载玻片上的两虫。
c.把载玻片放入一个潮湿的容器内，室温至少放置40分钟（可以适当延长，
过夜也可）。
如果放入37℃培养箱则需要放置30分钟。
d.吸掉其表面的多余液体，加入50ul的fixing Buffer静置2分钟。
吸掉
多余的液体。
e.加入50ul的DAPI染色稀释液（注意需要稀释5000倍，即2ul—10ml，
现用现配），并放置1分钟。
吸掉多余水分，加1滴fixing Buffer,1分钟后再吸掉多余的水分。
（注意不要使涂片干燥）
f.加一滴mounting mediun，加上盖玻片，并用棉纸吸掉多余的液体。
在盖
玻片周围涂上透明的指甲油。
g.记录下时间和日期。
如果涂片不马上进行镜检则将其放置0-8℃的潮湿黑
暗环境中。
h.试剂盒储存在4℃的冰箱内，切勿冷冻。
五、结果判读。