综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定
酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定的改进方法
一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类,它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。
酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。
在这个过程中,酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。
二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度:传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质,导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。
2. 酶活测定不精准:常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差,难以得到准确的酶活性数据。
3. 操作繁琐:传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤,耗时且操作繁琐。
三、改进方法鉴于传统方法存在的问题,我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法,主要包括以下几个关键步骤:1. 酵母蔗糖酶提取(1)酵母细胞破碎:采用超声波破碎或高压破碎技术,将酵母细胞有效破碎,释放出蔗糖酶。
(2)蛋白质沉淀:利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质,提高酶的纯度。
2. 酶活测定(1)比色法测定:采用改良的Folin-Phenol比色法,提高对酶活性的测定准确性。
(2)酶活性计算:采用新的酶活性计算公式,更准确地反映酶的活性水平。
四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定,得到的结果表明,与传统方法相比,改进方法在以下几个方面有了显著改善:1. 提取纯化效果显著:采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高,杂质含量大幅降低。
2. 酶活测定更准确:采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠,对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。
3. 操作简便高效:改进方法简化了提取纯化的操作步骤,减少了操作时间,提高了实验效率。
五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果,显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性,为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。
该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展,促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力(Unit/mg)=总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四:离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂(如:羧甲基纤维素:CM-纤维素)和阴 离子交换剂(如:二乙氨基乙基纤维素: DEAE-纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下,蔗糖酶催化蔗糖水解,生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化,二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液,其蓝色深度与还原
糖的量成正比,于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液,pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中,注意不要扰动柱床,上样后,用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质,当A280nm 值降低稳定后,可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液(含1 mol/L NaCl), 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三:蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 (G-250法)
酵母蔗糖实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 了解并掌握酶活性的测定方法。
3. 探讨酵母蔗糖酶在不同条件下的活性变化。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种糖苷水解酶,能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶,并对其进行活性测定,从而了解其催化性能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 酵母细胞- 蔗糖- 磷酸盐缓冲液(pH 6.0)- 3,5-二硝基水杨酸(DNS)2. 实验仪器:- 电子天平- 研钵- 离心机- 恒温水浴锅- 酶标仪- 移液器- 试管四、实验步骤1. 酵母细胞提取(1)称取一定量的酵母细胞,用磷酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涤2-3次,去除杂质。
(2)将洗涤后的酵母细胞加入研钵中,加入适量的磷酸盐缓冲液,研磨均匀。
(3)将研磨后的酵母细胞悬液用离心机以3000r/min离心10分钟,取上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活性测定(1)取一定量的蔗糖溶液,加入适量的磷酸盐缓冲液(pH 6.0),调节pH值至6.0。
(2)取适量的酵母蔗糖酶提取液,加入上述蔗糖溶液中,混匀。
(3)将混合液置于恒温水浴锅中,在37℃下反应30分钟。
(4)取反应后的溶液,加入适量的DNS试剂,混匀。
(5)将混合液置于沸水浴中反应5分钟,终止反应。
(6)用酶标仪在540nm波长下测定吸光度值。
3. 数据处理根据实验数据,计算酶活性单位(U/mL)。
五、实验结果与分析1. 酵母蔗糖酶提取通过实验,成功提取了酵母细胞中的蔗糖酶,提取液的酶活性较高。
2. 酶活性测定通过酶活性测定实验,得到了酵母蔗糖酶在不同条件下的活性变化情况。
实验结果显示,酵母蔗糖酶在pH 6.0、37℃条件下活性最高,酶活性单位为(U/mL)。
3. 讨论(1)实验过程中,酵母细胞洗涤次数不宜过多,以免影响酶的提取效率。
(2)酶活性测定过程中,pH值和温度对酶活性影响较大,需严格控制实验条件。
(3)本实验中,酵母蔗糖酶提取液的酶活性较高,说明酵母细胞中含有丰富的蔗糖酶。
实验5-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
六.实验方法
(一)粗提取酵母蔗糖酶 (1) 量取5g的面包酵母,分几次研磨(加入少 量石英砂)至粉状(注意:一定要研磨成匀浆状), 再加入10-12mL的0.01mol/LPBS(pH 6.0),搅拌混合。 置于小烧杯中。 (2) 置于-20℃冰箱中,反复冻融1-2次。 注意:讲课前提前处理好材料,做好1 注意:讲课前提前处理好材料,做好1、2步骤的实验
实验六
酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
目的: 一、目的:
1 学习和掌握从酵母中提取蔗糖酶的实验方法 2 学习和掌握测定蔗糖酶活性、比活力等实验 方法和技术。 3 学习和掌握测定蛋白浓度的实验方法和技术。
原理: 二、原理:
蔗糖酶活性及比活性测定原理 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式, 一种存在细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的胞外 蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分,含有50 %糖成分。该酶是蔗糖酶的主要形式。而另一种 是存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的胞内 蔗糖酶。蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果 糖。葡萄糖和果糖具有还原性,可与3,5 - 二 硝基水扬酸共热后被还原成棕红色物质,在一定 范围内,葡萄糖的含量和反应液的颜色强度成正 比例关系。 1
2 蔗糖酶蛋白含量的测定原理(略)
三.实验材料
酵母
四.仪器设备
(1)离心机4000~1000rpm 3-5台; (2) 752分光光度计(玻璃比色杯)5-6台; (3) 水浴锅2台; (4)冰箱1台; (5)电子天平3台,台式天平(离心平衡用)4台; (6)剪刀2把; (7)碾钵(1个/组); (8)电炉 2-3个; (9)锅2-3个; (10)试管架等 准备冰块,恒温水浴锅,电炉。
40℃恒温水浴准确保温10min
100℃沸水浴准确加热5min,立即冷却 摇匀,以对照管作空白
综合性试验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定
综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测(一)实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度,用3.5 —二硝基水杨酸法测定酶活力。
掌握各步骤的实验原理和方法。
(二)实验原理本实验采用Bradford法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定蛋白浓度,属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。
其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用作蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在OD465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为OD595nm其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡,反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法高近4倍,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度,在10~100gg/mL蛋白质浓度范围内成正比。
因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数,使其测定值在标准曲线的直线范围内。
本实验采用DNS法[11]测定,属于染料结合法的一种。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中蔗糖(双糖)和淀粉(多糖)是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的1,2-糖昔键裂解,释放出等量的D-葡萄糖和D-果糖[12]。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5 —二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸(图1)。
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶,并在一定条件下测定其活力,以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料:1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器:1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉,加入少量蒸馏水,研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中,离心分离,收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液,加入含有蔗糖的缓冲液,置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样,用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应,观察酶的催化活性。
- 对比实验结果,分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定,观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定,观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下,酶活力最高,约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用,而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下,酶活力最高;在酸性或碱性条件下,酶活力明显降低;在低温条件下,酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶,并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用,对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大,适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中,酶活力的测定方法较为简单,但结果准确可靠。
2-蔗糖酶的催化反应及活力测定.
一.实验目的
1.学习掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖的 原理和方法;
2.学习掌握酶的活力测定及其计算方法。
二.实验原理
蔗糖酶活力测定的原理
1.蔗糖 蔗糖酶 D-果糖 + D-葡萄糖
(非还原糖)
(还原糖)
2.酶活力=酶活力单位/ml=U/ml
3.酶活力单位:在本实验条件下,每min释放1mg 还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位
三、试剂和器材
(一)试剂: 1. 蔗糖酶溶液 2. 5%的蔗糖溶液 3. DNS (3,5二硝基水杨酸试剂) 4. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 2mg/ml的葡萄糖标准液 (二)器材: 1.移液管、吸耳球 2.试管、血糖管(或刻度试管) 3.秒表 4.沸水浴 5.恒温水浴 6.分光光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸
如样液有外溢,先用滤纸条吸干(不许檫);再用镜头 纸向一个方向檫至透明;
倒出液体后,一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净,然后倒置 在滤纸上吸干;
任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上; 自备废液杯(盛废液及废纸块用)
2.蔗糖酶的活力测定
取酶液2ml,按2倍稀释,分装两支试管,每支 试管2ml,一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH, 摇匀,使酶失活(做参比),另一支做测定 管;
②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标, 画出工作曲线。
试号 含糖量 葡萄糖标准 去离子水 3,5-二硝基水 光吸收值
(mg) 液(ml)
(ml) 杨酸试剂(ml)
A540
0
0
0
2.0
3.0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 0.8
蔗糖酶综合性实验报告
一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能;2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法;3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术;4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶,可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取和纯化蔗糖酶,测定其活力和专一性,并分析影响其活性的因素。
三、实验材料与试剂1. 实验材料:酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等;2. 实验试剂:氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等;3. 实验仪器:旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 蔗糖酶提取(1)将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中,37℃培养24小时;(2)收集培养液,离心分离菌体;(3)将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中,加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠,超声波破碎菌体;(4)离心分离酶液,得到粗提蔗糖酶。
2. 蔗糖酶纯化(1)将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化;(2)收集沉淀,用磷酸缓冲溶液溶解,透析去除小分子物质;(3)通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力测定(1)采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力,以葡萄糖生成量为指标;(2)设置不同浓度的蔗糖溶液,在特定条件下测定酶活力;(3)绘制酶活力曲线,确定最适酶浓度和反应时间。
4. 蔗糖酶专一性实验(1)将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物;(2)通过比色法测定反应产物的生成量;(3)分析酶对不同底物的催化效率,确定蔗糖酶的专一性。
5. 影响蔗糖酶活性的因素实验(1)考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响;(2)设置不同pH、温度、离子强度等条件,测定酶活力;(3)分析影响蔗糖酶活性的因素。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离,成功提取出粗提蔗糖酶。
经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法,纯化得到较高纯度的蔗糖酶。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中,少量多次地加入50ml蒸馏水,搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯,搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min,然后补加30ml蒸馏水,搅匀,盖好,于35℃恒温过夜。
之后,1000r/min离心10min,抽取酯层后再次离心,得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0,即可得到级分Ⅰ。
(取出3ml于冰箱中保存)2、热处理(1)盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。
(2)取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,1000r/min离心10min。
(3)上清液即为热级分Ⅱ。
(取出3ml于冰箱中保存)3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中,放入冰浴,逐滴加入等体积预冷的95%乙醇,同时轻轻搅拌(此过程共需30 min)。
然后在冰浴中静置10 min,以沉淀完全。
然后4℃,1000r/min离心10min。
倾去上清,并滴干。
将沉淀保存于离心管中,冷冻保存,此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下:三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(一)还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ:取50μl稀释至1.5ml(30倍)级分Ⅱ:取50μl稀释至1.5ml(30倍)级分Ⅲ:取50μl稀释至15ml(300倍)取20μl稀释至2ml(100倍)释100倍。
在上述表格中,Glu含量是由标准曲线求得的,E'=Glu含量*稀释倍数/(10 min*0.6 ml)Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知,第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白(第一个峰一般情况下是杂蛋备注:由测定数据可知,第二个峰不是目标蛋白,第三个峰为目标蛋白。
(二)蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知,级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释,级分Ⅲ需稀释5倍。
实验二酵母蔗糖酶
实验原理
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法; 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。 (自学)
提取工艺和酶活测定
1.
蔗糖酶
蔗糖酶的耐热温度为50度,45度以下可保持酶活不变;在 pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活; 蔗糖酶的活性中心有巯基,因此在提取时应防止其被氧化, 或者加入还原剂(如Vc)保持酶活力; 酵母细胞存在两种蔗糖酶,一种在细胞壁中,一种在细胞 质内,前者活力较高,分子量较大(约270KDa),后者活 力较低,分子量约为135KDa,两种酶的底物专一性和动力 学性质十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶。
2、DNS法测定还原糖量
试剂 粗酶液组 测定组1 水解液 (mL) 蒸馏水 (mL) DNS液 (mL) 1 对照组1 1 纯酶液组 测定组2 1 对照组2 1
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
沸水浴5min,自来水冷却,稀释至10mL,以对照组调零,记 录测定组OD540nm。
实验结果
2.
3.
1.
2.
3.
4.
5.
提取酶注意事项 了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性, 选择合适的提取条件; 提取过程中采用缓冲液系统溶解酶,并可添加 一些保护剂(如还原剂、金属螯合剂等); 提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、 强碱等变性的因素; 一般先选择分辨率低处理量大的方法(如萃取、 沉淀、吸附)浓缩酶,再采用分辨率高的方法 (如离子交换层析、亲和层析、超滤)精制; 通过酶活测定,调节提取条件。
1.
测定酶活的原理
蔗糖酶可作用于 β - 1 , 2 糖苷键,将蔗糖水解为 D -葡 萄糖和D-果糖; Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂,Mn2+ 是其抑制剂。 葡萄糖和果糖具有还原性,在偏碱性条件下,可与 3 , 5 -二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质,在一定浓度范 围内,还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。 蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。
本实验属综合性实验,接近研究性实验,包括八个连续的实验内容,通过对蔗糖酶的提纯和性质测定,了解酶的基本研究过程;同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。
本实验技术多样化,并且多个知识点互相联系,实验内容逐步加深,构成了一个综合性整体,为学生提供一个较全面的实践机会,学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶,并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶(invertase )(β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranoside fructohydrolase )(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖,就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法,本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量,由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用,才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中,蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料,通过破碎细胞,热处理,乙醇沉淀,柱层析等步骤提取蔗糖酶,并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化(一)实验目的学习酶的提取和纯化方法,掌握各步骤的实验原理,并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
(二)实验原理(略) (三)实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、-20℃冰箱2. 电子天平、研钵(>200ml )、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管(2ml ,10ml ,30ml 或50ml )、移液器(1000ul )或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母(低温保存)+ H 2O 蔗糖酶O HH O2.石英砂(海沙)、甲苯(使用前预冷到0℃以下)3.95%乙醇(预冷-20℃)、去离子水(使用前冷至4℃左右)4.Tris-HCl(pH7.3)缓冲液(四)操作步骤1. 提取(1)将市售鲜啤酒酵母2000 rpm,离心10 min,除去大量水分。
蔗糖活力测定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解蔗糖酶的活力测定原理和方法。
2. 掌握分光光度计的使用技巧。
3. 通过实验,掌握如何测定蔗糖酶的活力。
二、实验原理蔗糖酶活力测定是通过测定在一定条件下,酶催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的速率来衡量酶的活力。
在本实验中,采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量,进而计算蔗糖酶活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 蔗糖酶- 蔗糖- 3,5-二硝基水杨酸- 碳酸钠- 氢氧化钠- 硫酸铜- 碘化钾- 硫酸铁铵- 水浴锅- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表2. 实验仪器:- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表四、实验步骤1. 配制反应液:- 称取0.1g蔗糖酶,加入1ml蒸馏水溶解。
- 称取0.5g蔗糖,加入5ml蒸馏水溶解。
- 将蔗糖溶液和蔗糖酶溶液混合,总体积为10ml。
2. 水解反应:- 将混合液放入水浴锅中,设定温度为50℃,反应时间为30分钟。
3. 还原糖测定:- 取3ml反应液,加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml,混匀。
- 将混合液放入水浴锅中,加热至沸,反应时间为2分钟。
- 冷却至室温,用蒸馏水定容至10ml。
4. 比色:- 使用分光光度计,以蒸馏水为参比,测定混合液在540nm处的吸光度值。
5. 结果计算:- 根据标准曲线,计算还原糖含量。
- 根据还原糖含量和反应液体积,计算蔗糖酶活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制:- 以不同浓度的葡萄糖溶液为标准,绘制标准曲线。
2. 蔗糖酶活力计算:- 根据实验数据,计算蔗糖酶活力。
3. 结果分析:- 通过比较不同实验条件下蔗糖酶活力,分析影响酶活力的因素。
六、实验结论通过本实验,我们成功掌握了蔗糖酶活力测定的原理和方法。
实验结果表明,在一定条件下,蔗糖酶活力与还原糖含量呈正相关,说明蔗糖酶具有催化蔗糖水解的能力。
七、实验注意事项1. 实验过程中,注意保持反应液的温度恒定。
2. 使用移液管时,注意避免气泡产生。
酵母蔗糖酶Km值的测定(精)
酵母蔗糖酶Km值的测定
目的与要求:
学习米氏常数的测定原理及方法, 认识底物浓度对酶促反应速度的影响。
实验原理:
影响酶促反应速度的因素有:底物浓度、酶的浓
度、pH值、环境温度等。当环境温度、pH值和酶浓 度等条件相对恒定时,酶促反应的初速度v随底物浓 度增大而增大,直到酶全部被底物所饱和时达到最 大速度Vmax。反应初速度与底物浓度间的关系可用 米-曼氏方程式表示。将两边取倒数,采用双倒数作 图法可求得Km值。
操作步骤
干净大试管5只编号,按 P45表加入试剂.混匀,37
C15min.
取出后加入1mol/L NaOH 0.5ml,摇匀终止反应。 按 P45表加入试剂.混匀,沸水浴5min,流水冷却,
稀释到12.5ml.
540nm测 OD值。
结果与计算:
在横坐标上查得酵母蔗糖酶的Km值。
注意事项:
《酵母蔗糖酶》PPT课件
12
精品医学
实验结果
计算酶活力
将吸光值代入还原糖标准曲线,得到水解液中还原糖的质量。 Y=0.67X+0.027(Y:吸光值;X:还原糖的质量(mg)) 蔗糖酶活力定义:在一定实验条件下,在规定时间内释放1mg还原糖的酶量 为一个活力单位。 酶活力(U/mL)=还原糖毫克数×3.5(水解液体积)÷1.0(酶液体积)
0.5
-
0.5
0.5 2.0
-
精品医学
2、DNS法测定还原糖量
试剂
水解液 (mL)
粗酶液组
测定组1 对照组1
1.0
1.0
纯酶液组
测定组2 对照组2
1.0
1.0
蒸馏水
1.0
1.0
1.0
1.0
(mL)
DNS液
1.0
1.0
1.0
1.0
(mL)
沸水浴5min,自来水冷却,稀释至10mL,以对照组调零,记 录测定组OD540nm。
实验二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活测定
1
精品医学
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶的方法; 测定蔗糖酶活力的方法。
2
精品医学
实验材料
材料:活性干酵母粉、石英砂; 试剂:95%冰乙醇、DNS液、PBS(pH7.2)、
5%蔗糖溶液、1N NaOH溶液; 仪器:水浴锅、离心机、722型分光光度计。
3
精品医学
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精品医学
酶活测定 1. 蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖
试剂
(均35度预 热)
粗酶液组 测定组1 对照组1
酶液(mL)
1.0
1.0
纯酶液组 测定组2 对照组2
1.0
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1.冷冻离心机 2.研钵 3.恒温水浴箱 4.-20℃冰箱 5.梯度混合器 6.层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤:(以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中,不同的蛋白质 所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时,使某一种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂 的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来,达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可),以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后,用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器,混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl,pH7.3缓冲液,其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测:
取试管若干支编号,各加入0.5mL 5%蔗糖 (pH4.6),每隔一管取100uL收集液,按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀, 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸,于沸水浴中煮沸5min,用自来水冷却,直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
浙江大学生物化学实验甲 2011-蔗糖酶蛋白质浓度和酶活性测定的原理
将所得的试验数据以蛋白含
量为横坐标, OD640值为纵
坐标,绘制标准曲线。
2、未知样品蛋白含量的确定。
未知 蛋白含量 (ug)
根据未知样品的OD640值,过标准曲线求出未知 样品的蛋白含量。
二、蔗糖酶活力的测定原理
蔗糖 蔗糖酶 H2 O 葡萄糖 + 果糖
HO
CH2OH O OH CH2OH O + HO CH2OH OH HO OH OH
1.3、Lowry法的特点
Lowry法测得的含量为蛋白质的相对含量,样品浓
度需按标准曲线进行校正。
可测范围:2-100微克。 操作比较简单,重复性较好,是至今生物化学研究 中应用最多的方法。 缺点:酚类和其它具有还原性的物质对显色反应有 干扰, 另外,该法标准曲线线性不是很好,因此每次测定
均需制作标准曲线。
还原糖 + 3,5-二硝基水杨酸
(DNS试剂)
OH-
△
糖酸 + 氨基化合物
红棕色,540nm处 具特征光吸收, OD540值与还原糖 含量成正比,可据 此进行比色测定。
蔗糖酶活力单位(units):在50℃,pH4.6条件下,
每分钟能产生1mg还原糖的酶量。
一、蔗糖酶蛋白质含量的测定
碱性铜试剂 试剂甲 蛋白质 铜-蛋白质络合物 (双缩脲反应) 紫红色 铜-蛋白质络合物
磷钼酸-磷钨酸 试剂乙 (福林-酚试剂)
磷钼蓝 + 磷钨蓝
蓝色,640nm处有 特征光吸收,OD640 值与溶液中的蛋白含 量成正比, 可据此通过 比法色测定蛋白质的 含量。
一、蔗糖酶蛋白质含量的测定
1.2、 比色法的测定原理
磷钼蓝和磷钨蓝的OD640 值与溶液中的蛋白含量成正
酵母蔗糖酶的制备与活力测定
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定一、目的要求1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。
2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)测定酶活力的原理和方法。
3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。
二、实验原理蔗糖酶(invertase)(β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。
每水解1mol蔗糖,就生成2mol还原糖。
还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物,而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖的含量。
酶活力单位的定义:在一定条件下,反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位(U)。
三、仪器与试剂1. 仪器研钵,天平,离心机,721型分光光度计,恒温水浴,具塞试管25ml,沸水浴,移液器(1000ul、200 ul)2. 试剂市售酵母干粉,石英砂,丙酮(预冷), 1mg/ml葡萄糖溶液,pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液,3,5-二硝基水杨酸溶液。
四、实验方法1. 蔗糖酶制备称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中,加适量蒸馏水,用力研磨30分钟成糊状,再加蒸馏水100ml,搅匀,6层纱布过滤,滤液加2倍体积冷丙酮搅匀,静置5分钟,离心管中,平衡后3000 rpm离心10 min,弃上清取沉淀。
沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。
沉淀真空干燥后称重。
再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟,用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。
2. 蔗糖酶活力测定(1)制作葡萄糖标准曲线取7支具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂,配成不同浓度的葡萄糖反应液。
蔗糖酶分离纯化与活力测定
考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮兰G 250在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。 考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。 在酸性溶液时呈茶棕色 465nm 当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm,在10当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm, 10595nm 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比 蛋白质浓度范围内成正比; 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比; 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数,使其测定值在标准曲 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数, 线的直线范围内 根据所测定的A595nm值 在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量, 根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量, A595nm 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL) 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)
热处理和乙醇沉淀
预先将恒温水浴调到50℃ 将盛有粗级分I 50℃, (1) 预先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥 下保温30分钟, 地放入水浴中,50℃下保温30分钟 地放入水浴中,50℃下保温30分钟,在保温过程中不断轻 摇离心管。 摇离心管。 取出离心管, 冰浴中迅速冷却, 4℃,10000rpm, (2) 取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,10000rpm,离 10min。 心10min。 将上清液转入小烧杯中,放入冰盐浴( (3) 将上清液转入小烧杯中,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒 入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇 ),逐滴加入等体积预冷至 乙醇, 入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇, 同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟, 30分钟 10分钟 同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟, 以沉淀完全。 4℃,10000rpm,离心10min 倾去上清, 10min, 以沉淀完全。于4℃,10000rpm,离心10min,倾去上清, 并滴干,沉淀保存于离心管中,盖上盖子或薄膜封口, 并滴干,沉淀保存于离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然 后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ )。 后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ”)。
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综合性实验 2 酵母蔗糖酶浓度及酶活力测 定(一)实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度,用 3.5-二硝基水杨酸法测定酶活力。
掌握 各步骤的实验原理和方法。
(二)实验原理本实验采用 Bradford 法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定蛋白浓度,属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝有 G250 和 R250 两种。
其中考马斯亮蓝 G250 由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用作蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝 R250 与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在 OD465nm。
当它与蛋白质结合形 成复合物时呈蓝色,蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为 OD595nm,其光吸收值与蛋白质含 量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝 G250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡,反应十分迅速,其结合物在室温下 1h 内保持稳定。
该法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比 Lowry 法高近 4 倍,考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度,在 10~100μg/mL 蛋白质浓度范围内成正比。
因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数,使其测定值在标准曲线的直线范围内。
本实验采用 DNS 法[11]测定,属于染料结合法的一种。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中蔗糖(双糖)和淀粉(多糖)是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的 1,2-糖苷键裂解,释放出等量的 D-葡萄糖和 D-果糖[12]。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸(图 1)。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,可利用分光光度计进行比色测定,查对标准曲线,求得样品中的含糖量。
O2NCOOH OH+ 还原糖NO2加热 碱性COOH OHO2NNH2图 1 3,5-二硝基水杨酸还原反应(三)实验仪器、材料及试剂1.仪器 (1)722 型(或 7220 型)分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱 (2)量筒、容量瓶、移液器、试管。
2.材料及试剂 (1) 考马斯亮蓝(G250)染液(0.01%):称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95%乙醇中,再加入 100ml 浓磷酸(市售质量百分渡为 85%),然后加蒸馏水定容至 1L。
(2) 5%蔗糖 (3) 1mg/ml 葡萄糖 (4) 0.9% NaCl 溶液 (5) 人血清标准蛋白液(0.1mg/ml):人血清蛋白标准液,用 0.9% NaCl 溶液溶解并 稀释至 0.1mg/ml 。
(6) DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂配制:准确称量 12.6g 3,5-二硝基水杨酸,量取524mL 2mol/L NaOH 溶液,加到 1000mL 含有 370g 酒石酸钾钠(C4H4O6KNa·4H2O, MW=282.22)的热水溶液中(预热至 50℃左右),再加 10g 结晶酚和 10g 亚硫酸 钠(NaS2O3),搅拌溶解,冷却后移入 2000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至 2000mL, 贮于棕色瓶中避光,4℃保存,于 2 周内使用,使用过程中尽量减少与空气接触。
(7) 0.2mol/L 乙酸缓冲溶液(pH5.0): (a)0.2mol/L NaAC:称取 2.7616g NaAC 溶解并定容至 100ml。
(b)0.2mol/L HAC:10ml 乙酸(分析纯)定容至 50ml。
将两者分别取 63ml、37ml 混合成 100ml,用强碱调 pH 到 5.0。
(四)操作步骤1. 各级分蛋白质浓度测定 (1) 蛋白质浓度测定――标准曲线 取 8 支干净试管,按表 1 编号并加入试剂混匀,记录 A595nm 值。
以吸光度值为纵坐标,各管蛋白含量(μg/ml)作为横坐标绘制标准曲线。
表 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制试剂(ml)blank12345670.1M 标准蛋白液 00.9%NaCl1.0考马斯亮蓝 G250 4.00.10.20.30.40.50.6 0.70.90.80.70.60.50.4 0.34.04.04.04.04.04.0 4.0充分混匀上述各管,室温静置 5min,以空白管溶液调 T=100%,读取各管的吸光度值。
(2)各分级蛋白浓度的测定各分级酶液先稀释一定倍数,然后按照表 2 所示,取 4 支干净试管加入各组试剂,测量的吸光度值在标准曲线内,即蛋白含量应在 10~80μg 的稀释度为宜。
表 2 考马斯亮蓝法测定各分级蛋白浓度(N=稀释倍数)试剂(ml) 酶液粗酶液Ⅰ(N1) 0.2粗酶液Ⅱ(N2) 0.2粗酶液Ⅲ(N3) 0.20.9%NaCl0.80.80.8考马斯亮蓝 G2504.04.04.0充分混匀上述各管,室温静置 5min,以空白管溶液调 T=100%,记录各管 A595nm 值。
查 标准曲线即可求出蛋白质含量。
注意:稀释后的各管吸光度值应在标准曲线内,即蛋白含量应在 10~80μg 的稀释度为宜。
2. 各分级蔗糖酶活性的测定 (1)蔗糖酶活性的测定――标准曲线取 9 支试管,按表 3 加样,将各管溶液混匀后,进行比色测定记录 A520nm 吸光度值。
以 还原糖浓度(μmol/ml)为横坐标,A520nm 为纵坐标,绘制出标准曲线。
表 3 DNS 法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制样品(ml) 1mg/ml 葡萄糖 蒸馏水blank 123456780 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.400.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10DNS 试剂1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0混合均匀,沸水浴中加热 5min,取出立即用冷水冷却至室温蒸馏水4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0将上述各管溶液混匀后,以空白管溶液调 T=100%,进行比色测定,测定各管 A520nm 值。
(2)各级分蔗糖酶活性测定取 5 支干净试管,分两组,按表 4 编号并加入试剂混匀,以空白管溶液调 T=100%,读取吸光度值,查标准曲线即可求出葡萄糖的含量。
各分级应先稀释一定倍数预做,柱分级Ⅳ用原液,选其吸光度值在标准曲线内为宜)表 4 DNS 法测定各分级蔗糖酶活性(N=稀释倍数)样品 (ml) 0.2M 乙酸缓冲液5%蔗糖 蒸馏水 酶液blank 0.4 0.4 1.2 0DNS 试剂1.0蒸馏水4.0粗酶液Ⅰ(N1)粗酶液Ⅱ(N2)粗酶液Ⅲ(N3)0.40.40.40.40.40.41.01.01.00.20.20.2立即混匀后,40℃保温 10min1.01.01.0沸水浴中加热 5min,取出立即用冷水冷却至室温4.04.04.0混匀上述各管,测量各管 A520nm 值。
3. 各分级蛋白质浓度及酵母蔗糖酶活性的测定 蔗糖酶活力单位(U):在 40℃、pH5.0 条件下,以 1min 内水解产生 1μmol 还原糖所需酶量为 1 个活力单位。
蔗糖酶比活力:每 mg 蛋白质所具有酶活力单位数,一般用酶活力单位 U/mg 蛋白质表示。
酶的比活力:在酶学研究中用来衡量酶的纯度。
对同一种酶来说,比活力越大,没得纯度就越高。
利用比活力的大小可比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶纯度 高低的一个重要指标。
(五)实验结果与分析记录实验结果,计算出各步数据填入下表 5 中。
各分级样液 体积(ml)总蛋白(mg)活力(U)比活力(U/mg)粗酶液 I 粗酶液 II 粗酶液 III1mlP1=C1×N1 /0.2ml ×1ml U1 =C I×N1 /(0.2ml×10min)= U1/ P1VIIP2=C2×N2 /0.2ml ×1ml U2 =C II×NII/(0.2ml×10min)= U2/ P21mlP3=C3×N3 /0.2ml ×1ml U3 =CIII×NIII/(0.2ml×10min) = U3/ P3注:C1 ~ C3: 表示蛋白浓度;N1~N3: 表示稀释倍数; C I ~ CIII: 表示还原糖浓度;P1~P3:表示各分级酶液总蛋白量;U1~ U3:表示各分级酶活力。