综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测定

综合性实验 2 酵母蔗糖酶浓度及酶活力测 定
（一）实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用 3.5－二硝基水杨酸法测定酶活力。掌握 各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理
本实验采用 Bradford 法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定
蛋白浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具
有高敏感性。考马斯亮蓝有 G250 和 R250 两种。其中考马斯亮蓝 G250 由于与蛋白质的结
合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝 R250 与蛋白质反应虽然比较缓慢，
但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在 OD465nm。当它与蛋白质结合形 成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为 OD595nm，其光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G250 结合在 2min 左右的
时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法试剂配制简单，
操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法高近 4 倍，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合
物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在 10~100μg/mL 蛋白质浓度范围内成
正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围
内。
本实验采用 DNS 法[11]测定，属于染料结合法的一种。还原糖的测定是糖定量测定的基
本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还
原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的 1,2-糖苷键裂解，释放出等量的 D-葡萄糖和 D-果糖[12]。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5
－二硝基水杨酸被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸（图 1）。在一定范围内，还原糖的
量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，可利用分光光度计进行比色测定，查对标准曲线，
求得样品中的含糖量。
O2N
COOH OH
+ 还原糖
NO2
加热 碱性
COOH OH
O2N
NH2

图 1 3,5－二硝基水杨酸还原反应
（三）实验仪器、材料及试剂
1.仪器 （1）722 型（或 7220 型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱 （2）量筒、容量瓶、移液器、试管。
2.材料及试剂 （1） 考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95%乙
醇中，再加入 100ml 浓磷酸（市售质量百分渡为 85%），然后加蒸馏水定容至 1L。 （2） 5%蔗糖 （3） 1mg/ml 葡萄糖 （4） 0.9% NaCl 溶液 （5） 人血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：人血清蛋白标准液，用 0.9% NaCl 溶液溶解并 稀释至 0.1mg/ml 。
（6） DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂配制：准确称量 12.6g 3,5-二硝基水杨酸，量取
524mL 2mol/L NaOH 溶液，加到 1000mL 含有 370g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O， MW=282.22）的热水溶液中（预热至 50℃左右），再加 10g 结晶酚和 10g 亚硫酸 钠（NaS2O3），搅拌溶解，冷却后移入 2000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至 2000mL， 贮于棕色瓶中避光，4℃保存，于 2 周内使用，使用过程中尽量减少与空气接触。 （7） 0.2mol/L 乙酸缓冲溶液（pH5.0）： （a）0.2mol/L NaAC：称取 2.7616g NaAC 溶解并定容至 100ml。 （b）0.2mol/L HAC：10ml 乙酸(分析纯)定容至 50ml。 将两者分别取 63ml、37ml 混合成 100ml，用强碱调 pH 到 5.0。
（四）操作步骤
1. 各级分蛋白质浓度测定 （1） 蛋白质浓度测定――标准曲线 取 8 支干净试管，按表 1 编号并加入试剂混匀，记录 A595nm 值。以吸光度值为纵坐标，

各管蛋白含量(μg/ml)作为横坐标绘制标准曲线。
表 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制
试剂(ml)
blank
1
2
3
4
5
6
7
0.1M 标准蛋白液 0
0.9%NaCl
1.0
考马斯亮蓝 G250 4.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6 0.7
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4 0.3
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
充分混匀上述各管，室温静置 5min，以空白管溶液调 T=100%，读取各管的吸光度
值。
（2）各分级蛋白浓度的测定
各分级酶液先稀释一定倍数，然后按照表 2 所示，取 4 支干净试管加入各组试剂，测量
的吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在 10~80μg 的稀释度为宜。 表 2 考马斯亮蓝法测定各分级蛋白浓度（N=稀释倍数）
试剂(ml) 酶液
粗酶液Ⅰ(N1) 0.2
粗酶液Ⅱ(N2) 0.2
粗酶液Ⅲ(N3) 0.2
0.9%NaCl
0.8
0.8
0.8
考马斯亮蓝 G250
4.0
4.0
4.0
充分混匀上述各管，室温静置 5min，以空白管溶液调 T=100%，记录各管 A595nm 值。查 标准曲线即可求出蛋白质含量。注意：稀释后的各管吸光度值应在标准曲线内，即蛋白含量
应在 10~80μg 的稀释度为宜。
2. 各分级蔗糖酶活性的测定 （1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线
取 9 支试管，按表 3 加样，将各管溶液混匀后，进行比色测定记录 A520nm 吸光度值。以 还原糖浓度（μmol/ml）为横坐标，A520nm 为纵坐标，绘制出标准曲线。
表 3 DNS 法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制
样品（ml） 1mg/ml 葡萄糖 蒸馏水
blank 1
2
34
5
6
7
8
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10