肾活检组织标本的制作

第三章

第10节

肾活检组织标本的制作

前言

肾活检病理是诊断肾脏疾病的重要手段，许多疾病的命名主要源于肾活检组织学改变，如局灶节段性肾小球硬化和膜性肾病。肾活检病理诊断的正确性与肾组织标本制作质量关系密切，质量不过关（如切片不够薄，染色不清晰）将直接造成诊断错误，因此，应重视肾活检标本处理（取材、固定、包埋、切片到染色）的各个环节，以保证病理诊断的正确性。

肾脏病理包括尸检和活检标本，对于肾脏疾病而言，主要是活检标本，本章主要介绍肾活检标本的处理。

目前常规肾活检标本来源有两类：一类为切割式活检，一类为穿刺抽吸式活检，前者所取组织较多，但对肾脏损伤较大，不便在临床推广，临床常采用穿刺抽吸式活检。

一、肾组织取材

肾活检穿刺时病理技术员必须到场，以便对肾组织标本进行正确的处理，在技术员不能到场的情况下，必须按以下要求对标本处理者进行培训：①处理穿刺所获组织应轻柔，避免牵拉或用力钳夹组织；②分取组织时应在蜡板上进行，用锋利的刀片快速切割，避免用力挤压组织；③尽量用含固定液（光镜或电镜）和生理盐水的专用镊子把分割好的组织块移入固定瓶内；用镊子时避免钳夹组织过度而造成组织受挤压；

④要求穿刺者尽量取两条组织。穿刺所获第一条含皮质组织送光镜检查，第二条组织在肉眼观察下进行分割，尽量切取皮质区1mm组织送电镜检查，余下组织送免疫荧光检查。如果穿刺仅获一条组织，所取组织有三种情况（图3-10-1）：整条均为皮质，皮髓组织和皮-髓-皮质组织，髓质区血供丰富，颜色略红，皮质区组织略白，分布的红色小点是肾小球，根据穿刺获取不同组织的情况，如图3-10-1所示进行分取。也有人建议纵切后，一半送光镜检查，一半分割后分送免疫荧光和电镜检查，但存在组织太细，不易观察的缺点，临床较少使用。⑤分送免疫荧光检查的组织用无菌的TRIS或PBS溶液浸湿的沙布轻轻包裹，置于培养皿中，避免直接置于冰块上，以免局部组织因冷冻收缩，造成结构破坏[1,2]。

肾活检穿刺组织的分取

图3-10-1 肾活检穿刺组织的分取

LM：光镜；IF：免疫荧光；EM：电镜

二、光镜标本的处理

（一）固定

光镜标本的固定液有多种。目前最常用的固定液为10%的中性福尔马林。中性福尔马林固定液的配方：甲醛（40%）100 ml、蒸馏水900 ml、磷酸二氢钠4 g、磷酸氢二钠6.5 g，固定时间至少6~12 h。

（二）前期处理

1. 脱水脱水的目的是去除固定和水洗后组织

中的水分，便于后续的透明和浸蜡，常用的脱水剂是乙醇或丙酮，后者脱水能力比乙醇强，但对组织收缩较大，致使组织变脆，多用于快速脱水。为了彻底脱水，一般常规采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水：①70%乙醇10~20 min，⨯2次；②80%乙醇10~20 min，⨯2次；③90%乙醇10~20 min，⨯2次；④95%乙醇10~20 min，⨯2次；⑤无水乙醇10~20 min，⨯2次。

2. 透明透明的目的是便于石蜡包埋，因为组织

脱水后，所用的脱水剂大多数不能和石蜡相混合，必须通过透明剂的作用才能浸蜡，所用的透明剂必须既能和脱水剂相混合，又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，不但能提出脱水剂，又能代替脱水剂利于石蜡的浸入。当组织全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，故称为透明。透明剂都是石蜡溶剂，绝大多数都不能与水混合，最常用的透明剂包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。

第三章

宜，沸点为144︒C，折光率为1.497，易挥发，无色透明液体，易溶于乙醇又能溶解于石蜡，不能和水混合，透明力强，作用较快。最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能停留过久。通常在组织进入二甲苯以前先经过1/2纯乙醇和1/2的二甲苯的混合液。

（2）甲苯：性质同二甲苯，沸点110.8︒C，价格亦较便宜，透明较慢，但优点是组织在其内停留12~24 h也不变脆，故优于二甲苯。

（3）氯仿：组织在其中浸存较久时收缩不明显，也不变脆。因为它的易挥发性，渗入组织的氯仿，高温时比二甲苯易挥发，是其优点。缺点是渗透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明时间较二甲苯时间延长2-3倍。

3. 浸透和包埋组织经过脱水和透明后，要让石

蜡等支持剂透入内部使组织变硬，并将组织包埋以利于切片，这个过程称为“浸透”和“包埋”。浸透的目的在于去除组织中的透明剂而代之以石蜡，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为有硬度的蜡块，便于切片。石蜡是最常用的包埋剂。使用优质石蜡能保证切片厚度，无刀痕。根据石蜡熔点不同，石蜡分为软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高。一般在室温高时用熔点高的蜡，室温较低时用熔点低的蜡。

4. 切片将蜡块修理成小梯形状，进行连续切

片，常规切片厚度为2 μm，有条件可进行1.5 μm的连续切片。对于特殊染色，如刚果红则需厚度为5 μm 的切片[3~5]。

（三）染色

肾组织标本既要观察细胞结构，又要观察基底膜病变，许多肾脏疾病与免疫复合物相关，因此肾活检

标本除常规苏木素-伊红（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多种特殊染色如PAS（periodic-acid schiff，PAS）、PASM（periodic acid-silver methenamine，PASM）和Masson三色染色等[6~8]。

1. 苏木素-伊红染色法HE染色法即常规染色

法，主要显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行全面观察。目前关于病理组织学的基本知识，绝大部分都是基于对HE染色切片的观察。在HE染色上基本可以观察到各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复。

（1）苏木素染液配制方法：将苏木素溶于乙醇，倾入明矾液中，混合后煮沸，加入氧化汞1 g，以玻棒搅匀，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷却。静置过夜，过滤封闭保存，用前若加5％醋酸则染色较佳。

配方为：苏木素0.9g、醋酸12 ml、氧化汞0.5~1.0 g、蒸馏水200 ml、纯乙醇10 ml、甘油20 ml、钾明矾20 g。

（2）伊红乙醇配制方法：将伊红乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊状，加数毫升蒸馏水即可，过滤，将滤出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95％乙醇200ml 中即可。

配方为：伊红1 g、蒸馏水 10 ml、醋酸数滴。

（3）染色过程：①切片常规脱蜡入水；②苏木素染色3~10 min；③自来水充分冲洗3~5 min；④0.5%~1%的盐酸乙醇分化数秒钟；⑤自来水冲洗1~5 min；⑥弱碱性水溶液返蓝；⑦自来水至蒸馏水冲洗5~10 min或更长；⑧0.5%~1%的伊红3 min；⑨乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（4）染色结果：细胞核被苏木素染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，黏液呈灰蓝色。细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞质内嗜酸性细胞颗粒被染成反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色。高质量的HE染色细胞核与细胞质蓝红相映，且胞核鲜明，核膜、核仁及核染色质颗粒均清晰可见（图3-10-2）。