菌种的复壮与保藏[行业特制]
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
8 行业内容
9 行业内容
2、创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复 突变细胞。
2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。 3）培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子。 4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利
12 行业内容
5、讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使 单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同 时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯 度。
13 行业内容
6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效
第三章 菌种的衰退、复壮与保藏
行业内容
1
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
2 行业内容
（一）菌种衰退的具体表现
1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件 下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少， 就表现为衰退。
4 行业内容
（二）菌种衰退的原因
1、基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 （2）表型延迟造成菌种衰退
如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产 量较高，进行复筛时产量却下降了。 （3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多， 不少抗生素的合成是受质粒控制的。
17 行业内容
2、宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 例如： 苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的 虫体内重新分离典型菌株。 根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤, 再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至 提高。
5 行业内容
2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突
变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞
数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
6 行业内容
3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重
11 行业内容
4、采用有效的菌种保藏方法
有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中， 应当有针对性的选择菌种保藏的方法。 例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低 温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不 理想。
短期保藏——一般斜面冰箱保藏法 长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。 对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
防止菌种衰退的方法。
14 行业内容
二、菌种的复壮
侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生
产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐 步提高。
2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4、致病菌对宿主侵染能力下降。 5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵
抗能力的下降等。
3 行业内容
➢ 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到 质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生 长优势，导致在群体中最后数量占优势。
21 行业内容
• 世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有 28家。
Ex：
美国的标准菌种保藏所（ATCC）
美国农业部农业研究服务部（ARS）
英国国立标准菌种保藏所（NCTC）
我国：中国科学院微生物研究所的普通微
生物菌种保藏管理中心（CCGMC）
武汉大学的中国典型培养物保藏中心
（CCTCC）
18 行业内容
3、淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温 等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。 例如：
有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处 理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存 活个体中留下了未退化的健壮个体。
19 行业内容
4、遗传育种法
15பைடு நூலகம்行业内容
复壮措施方法
• 纯种分离法 • 寄主体内复壮法 • 淘汰法 • 遗传育种法
16 行业内容
1、纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保 持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复 原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线 法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分 离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高 产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
20 行业内容
第二节 菌种的保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
1 经长期保藏后菌种存活健在； 2 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改 变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
7 行业内容
（三）菌种衰退的防治
1、控制传代次数
即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低 限度，以减少自发突变的机率。
于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
10 行业内容
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。
另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
9 行业内容
2、创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复 突变细胞。
2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。 3）培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子。 4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利
12 行业内容
5、讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使 单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同 时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯 度。
13 行业内容
6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效
第三章 菌种的衰退、复壮与保藏
行业内容
1
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
2 行业内容
（一）菌种衰退的具体表现
1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件 下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少， 就表现为衰退。
4 行业内容
（二）菌种衰退的原因
1、基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 （2）表型延迟造成菌种衰退
如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产 量较高，进行复筛时产量却下降了。 （3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多， 不少抗生素的合成是受质粒控制的。
17 行业内容
2、宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 例如： 苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的 虫体内重新分离典型菌株。 根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤, 再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至 提高。
5 行业内容
2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突
变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞
数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
6 行业内容
3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重
11 行业内容
4、采用有效的菌种保藏方法
有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中， 应当有针对性的选择菌种保藏的方法。 例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低 温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不 理想。
短期保藏——一般斜面冰箱保藏法 长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。 对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
防止菌种衰退的方法。
14 行业内容
二、菌种的复壮
侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生
产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐 步提高。
2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4、致病菌对宿主侵染能力下降。 5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵
抗能力的下降等。
3 行业内容
➢ 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到 质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生 长优势，导致在群体中最后数量占优势。
21 行业内容
• 世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有 28家。
Ex：
美国的标准菌种保藏所（ATCC）
美国农业部农业研究服务部（ARS）
英国国立标准菌种保藏所（NCTC）
我国：中国科学院微生物研究所的普通微
生物菌种保藏管理中心（CCGMC）
武汉大学的中国典型培养物保藏中心
（CCTCC）
18 行业内容
3、淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温 等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。 例如：
有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处 理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存 活个体中留下了未退化的健壮个体。
19 行业内容
4、遗传育种法
15பைடு நூலகம்行业内容
复壮措施方法
• 纯种分离法 • 寄主体内复壮法 • 淘汰法 • 遗传育种法
16 行业内容
1、纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保 持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复 原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线 法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分 离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高 产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
20 行业内容
第二节 菌种的保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
1 经长期保藏后菌种存活健在； 2 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改 变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
7 行业内容
（三）菌种衰退的防治
1、控制传代次数
即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低 限度，以减少自发突变的机率。
于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
10 行业内容
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。
另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。