临床生化检验技术

临床生化检验技术
主
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
要 内 容
光谱分析技术 电化学分析 电泳技术 层析技术 离心技术
第一节
光谱分析技术
一、光谱技术的分类 二、分光光度技术的基本原理 三、分光光度计的基本结构 四、分光光度计的操作方法 五、分光光度技术的定性和定量方法 六、火焰光度法 七、其他光谱技术
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据Lambert-Beer定律，当液层厚度为 cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为 摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度 为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长 下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。
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（三）偏离Lambert-Beer定律的因素 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。
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二、分光光度技术的基本原理
（一）吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光 被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光 强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：
T = I/I0
T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
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3．其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸 光系数分析等方法。
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六、火焰光度法
(一) 概述 (二)ห้องสมุดไป่ตู้仪器装置
(三) 定量分析原理
检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。
（五）显示器
是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。
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四、分光光度计的操作方法
（一）分光光度计的基本操作 以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：
1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上 比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）
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（二）Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：
A = KLC
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和 均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
光源种类：
可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用氢灯作为光源。
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（二）单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。 种类：
滤光片
棱镜
光栅
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（三）比色杯 又称为吸收池或比色皿
材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成
（四）检测器
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制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 （2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 （4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
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2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
1．光学因素：
要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。
2．化学因素： 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。
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三、分光光度计的基本结构
最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计
结构： 五大部份
光源
单色器
比色杯
检测器
显示器
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（一）光源 光源定义：
指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光 源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良 好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的 变化。
定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε 1.最大吸收波长λmax方法
2.摩尔消光系数ε方法
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（二）分光光度技术的定量方法 1.标准曲线法 方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内 与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（ 浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作 相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为 横座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法的原理，将 对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准 曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其 相应的浓度。
(四) 定量分析的方法 (五) 影响火焰光度法分析结果的因素
(一)概述
1、火焰光度法的定义 • 火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统 测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的
方法。
• 它是一种简化的发射光谱分析法。
2、火焰光度法的特点
①快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。 ②准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5 ％，可用于微量分析和常量分析。 ③灵敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0 ．1～10×10－6 g。 ④设备简单：被测试样易被火焰激发，产生的谱线较 简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的 设备简单。
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（二）吸光度的校正
铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光 度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的 0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长 下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进 行比较，可检测仪器吸光度的准确度。
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五、分光光度技术的定性和定量方法
（一）分光光度技术的定性方法
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一、光谱技术的分类
光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。 光谱分析技术分类： 发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和 荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子 吸收分光光度法和红外光谱法 散射光谱分析技术: 比浊法