实验荧光显微镜及激光共聚焦显微镜使用-PPT课件
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骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等 细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术） 细胞内氧自由基活性 细胞内钙离子浓度变化
膜电位
三、试剂与器材
青蛙 冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载 玻片、盖玻片 激光扫描共聚焦显微镜
四、实验步骤
1. 取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮40C固定 10 min; 2. PBS漂洗2次，每次3 min; 3. 滴加DAPI溶液100 ul室温孵育30 min; 4. PBS漂洗3次，每次5min; 5. 滴一小滴甘油/PBS封片剂(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封 片; 6. 激光扫描共聚焦显微镜观察。
三、试剂与器材
青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片 （HE染色）
甲醇、1ຫໍສະໝຸດ Baidu 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片
荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
四、实验内容和实验步骤
1. 蛙血细胞染色观察：取少许蛙血 → 常规血涂片→ 凉干 → 甲醇固定10 min → 1‰ 丫啶橙染色5 min → 水洗 → 室 温干燥（滤纸擦干玻片底面） → 荧光显微镜观察（先低倍 后高倍观察） （可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞） 2. 取洋葱→撕取一小片内表皮→平面单层铺展于玻片上→室温 凉干→1‰丫啶橙染色5min →水洗（用吸管，小心掉片） →室温干燥（或用滤纸擦干） →荧光显微镜观察 3. 暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范） 4. 观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释 放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
荧光的性质
保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
荧光显微镜的优点和用途
激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用
实验目的与要求
1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本 原理及其在生命科学中的应用。
Laser Scanning Confocal Microscope
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1. 普通荧光显微镜的不足
2. 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的重叠结构）。
Confocal Principle
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面， 这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学 薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强， 而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的 景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断 层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学 切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴） 扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经 过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维 图像。
实验七-1
细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用
（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）
实验目的与教学要求
1.
掌握荧光显微镜的成像基本原理及 其使用； 掌握暗视野显微镜的成像基本原理 及其使用。
2.
一、荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其 基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激 发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
荧光素的特性
ÓÓÓ DAPI AMC A Hoe ch st 33258 FITC Acri di n e O ran ge Acri di n e Ye l l ow C Y3 TRITC Propi di u m Iodi de ¤· Ó ÓÓ ¨Ó ¤ · ¢ É ä ² ¨³ ¤ 372 350 365 490 490 470 552 541 530 456 450 465 520 590 550 565 572 615
2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理
采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的 光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光 路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到 探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明 针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相 对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的 透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自 焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上 方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光 逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光 点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕 上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观 察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察 激发光源，保护眼睛。 3. 暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下 观察。
六、作业与思考题： 1.描述在荧光显微镜下所观察到 的实验现象。
2.绘图比较人正常肝组织细胞和脂 肪肝组织细胞。
实验七-2
荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用
1. 对细胞结构或组分的定性、定位、半 定量研究。 2. 作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
二、暗视野显微镜的成像原理
通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改 变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照 射到样品上，由样品表面的绕射光线入射 到物镜内，产生样品的衍射图象。
LSCM的基本特点
•观察方式：以荧光为主
•光源：激光（紫外、可见光、近红外）
•照明方式：点照明、逐点扫描 •成像方式：共聚焦、逐点成像 •输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 •多重染色样品的观察
3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用
细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞
膜电位
三、试剂与器材
青蛙 冷丙酮、 DAPI 、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载 玻片、盖玻片 激光扫描共聚焦显微镜
四、实验步骤
1. 取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮40C固定 10 min; 2. PBS漂洗2次，每次3 min; 3. 滴加DAPI溶液100 ul室温孵育30 min; 4. PBS漂洗3次，每次5min; 5. 滴一小滴甘油/PBS封片剂(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封 片; 6. 激光扫描共聚焦显微镜观察。
三、试剂与器材
青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片 （HE染色）
甲醇、1ຫໍສະໝຸດ Baidu 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片
荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜
四、实验内容和实验步骤
1. 蛙血细胞染色观察：取少许蛙血 → 常规血涂片→ 凉干 → 甲醇固定10 min → 1‰ 丫啶橙染色5 min → 水洗 → 室 温干燥（滤纸擦干玻片底面） → 荧光显微镜观察（先低倍 后高倍观察） （可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞） 2. 取洋葱→撕取一小片内表皮→平面单层铺展于玻片上→室温 凉干→1‰丫啶橙染色5min →水洗（用吸管，小心掉片） →室温干燥（或用滤纸擦干） →荧光显微镜观察 3. 暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范） 4. 观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释 放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
荧光的性质
保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
荧光显微镜的优点和用途
激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用
实验目的与要求
1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本 原理及其在生命科学中的应用。
Laser Scanning Confocal Microscope
一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1. 普通荧光显微镜的不足
2. 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的重叠结构）。
Confocal Principle
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面， 这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学 薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强， 而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的 景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断 层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学 切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴） 扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经 过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维 图像。
实验七-1
细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用
（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）
实验目的与教学要求
1.
掌握荧光显微镜的成像基本原理及 其使用； 掌握暗视野显微镜的成像基本原理 及其使用。
2.
一、荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其 基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激 发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品 结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
荧光素的特性
ÓÓÓ DAPI AMC A Hoe ch st 33258 FITC Acri di n e O ran ge Acri di n e Ye l l ow C Y3 TRITC Propi di u m Iodi de ¤· Ó ÓÓ ¨Ó ¤ · ¢ É ä ² ¨³ ¤ 372 350 365 490 490 470 552 541 530 456 450 465 520 590 550 565 572 615
2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理
采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的 光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光 路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到 探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明 针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相 对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的 透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自 焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上 方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光 逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光 点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕 上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观 察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察 激发光源，保护眼睛。 3. 暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下 观察。
六、作业与思考题： 1.描述在荧光显微镜下所观察到 的实验现象。
2.绘图比较人正常肝组织细胞和脂 肪肝组织细胞。
实验七-2
荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用
1. 对细胞结构或组分的定性、定位、半 定量研究。 2. 作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
二、暗视野显微镜的成像原理
通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改 变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照 射到样品上，由样品表面的绕射光线入射 到物镜内，产生样品的衍射图象。
LSCM的基本特点
•观察方式：以荧光为主
•光源：激光（紫外、可见光、近红外）
•照明方式：点照明、逐点扫描 •成像方式：共聚焦、逐点成像 •输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 •多重染色样品的观察
3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用
细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞