指纹图谱及高效液相

3-4 色谱柱问题的解决方案
• 在建立HPLC方法时三种重要的问题 • 1保留值与分离度发生变化；2谱峰拖尾；3色 谱柱寿命短 • （一）保留值的重现性是建立良好HPLC方法 的重要问题。解决的建议如下： • 与色谱柱有关：1 开始时选一支好的色谱柱， 硅胶基质酸性弱，纯度高，整个应用中都使用 同一固定相、粒度及柱尺寸。2 预先保存色谱 柱，或联系能连续提供同种柱的公司。
• 引起色谱柱失效的几个原因： 1进口滤片或柱床部分堵塞 2吸附有样品杂质 3柱填充不良 4机械及热冲击造成空洞 5担体或固定相遭受“化学侵蚀”
梯度洗脱
• • • • • 三 梯度洗脱用于初试 通过初始的梯度洗脱 ①可以估计出样品的保留值范围； ②决定用等度洗脱还是梯度洗脱 ③估计等度洗脱的适宜%B或梯度洗脱的 终止%B • ④了解样品的整体情况，避免有早流出 或晚流出组分被遗漏。
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问 题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反 冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲 醇（可加少量水）；反相柱可用异丙醇 加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇 +1%氢氧化铵20倍柱体积25cm的柱子 大约50ml
以上为主要查阅文献，还有一部分为选择性浏览或与以上文献有重复 内容故没有全部列出。
查阅内容总结
• 1.对指纹图谱的初步认识及对其在中药学领域应 用的了解 • 2.根据今后实验方向重点了解高效液相色谱指纹 图谱在中药学领域的应用 • 3.中药材用高效液相色谱法分析时具体操作方法 • 4.高效液相色谱指纹图谱在具体成药质量控制方 面的应用
查阅文献名称
• 用HPLC指纹图谱对复方丹参片的信息质量控制研究—孙 国祥 • 复方丹参片指纹图谱的质量评价研究—曾令杰 • 高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要 成分的含量—罗云 • 中药色谱指纹图谱研究及化学计量学方法的应用—徐小娜 • 青藏高原红景天药材的HPLC指纹图谱_李维卫 • 红景天活性成分及药理作用_袁瑜 • 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究_吴启 勋
指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 1. 观察指纹图谱的整体特征，鉴别生产前原料真 伪，对原料药进行质量控制用以保证其质量的稳 定。 • 2. 可区别药材不同部位，还可对不同采摘期的药 材进行分析，确定最佳生长年限和采收季节。 • 3. 指纹图谱可以考察商品药材及成药的质量，建 立各药材或成药的标准指纹图谱，可用于判断药 材优劣，区分正品与伪品。也可区别不同产地的 药材。
指纹图谱文献查阅总结
查阅文献名称
• 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研 究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研 究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的 含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
HPLC流动相的选择
乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-乙酸水溶液
流动相组分溶液浓度对色谱峰影响
在选择流动相体系若酸度较大时，峰型好的同时还须考 虑色谱仪酸承载能力
开始方法建立
• 首次HPLC分离较好的实验条件 • 色谱柱 C18、C8 5μm 15×0.46cm • 流动相 甲醇-水， 甲醇-甲酸水（？不太确定） 流速 1.5—2.0ml/min 温度 35—45℃ 样品量 体积<25μL 重量 <100 μg
中药指纹图谱技术分类
• （1)色谱法，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色 谱(HPLC) 、高效毛细管电泳(CE)和高速逆流色谱(HSCCC) , 等； • （2)波谱法，如红外光谱(IR) 和紫外-可见光谱(U-Vis)、X射 线衍射法以及核磁共振谱(NMR)等； • （3)色谱联用技术，如气相色谱-质谱联用(GC-MS) 和液相色 谱-质谱(LC-MS) 等； • （4)其他方法：电化学法、化学振荡技术、分子生物学方法等。 • 色谱法和色谱-质谱联用技术因其实用性较强而成为众多研究 方法中获取中药指纹图谱信息的主要手段。
三 压力降
• 同一支色谱柱的渗透性（压力降）或反压力应 该相似。 • 用球形微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估 算： P=3000Lη/（t0dp2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流 动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒的直 径。 新的色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时 要记录压力，这是色谱柱很重要的指标
分析方法的评价方式
• 精密度：取样品一定量按试验方法制备样品溶液， 24小时内连续进样5次，分析仪器及进样的精密 度。 • 重复性：取5份同样量的样品，按试验方法（制备 方法及色谱方法）进样分析，测分析方法的可重 复性。 • 精密度：取同一样品溶液室温下放置，48小时内 进样分析五次，分析样品溶液在室温下的稳定性。
图谱峰的确认
• 共有指纹峰的来源确认是将复方成药提取液的 HPLC 图分 别与其组方中各单味药提取液 HPLC 图相比较。通过比对 各指纹峰保留时间可知特征峰所代表的药效成分且确定该 峰是那个药材中成分的对应峰。 • 复方成药HPLC 指纹图谱中，找出一个最大峰（各谱中测 得均较稳定）为参照峰( S 峰) ，计算各色谱峰保留时间 • 和保留峰面积与同一图谱中 S 峰的保留时间和保留峰面积 比值，得到的相对保留时间和相对峰面积，进行指纹图谱 峰的标定。
用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液种 类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质的 “次级作用”。 流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液： HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲液加1体 积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容 到一定体积最准。如需控制PH值时应使用 酸度计，添加好的酸碱。 色谱柱的冲洗和预平衡：
指纹图谱的概述
• 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段， 它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主 要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真 实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性” 为其显著特点。
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中药指纹图谱研究意义
• 色谱、波谱以及光谱技术是实现指纹图谱对复杂样本质量控制 的依托；较于传统质量控制模式，指纹图谱体现的是复杂样本 整体化学成分的完整谱图，即复杂样本内在化学成分的整体性。 由于中药存在许多的次生代谢产物造成中药中各种化学成分组 成的不确定性，同一品种中药的化学指纹图谱会具有模糊性。 这两者作为指纹图谱的基本属性，它体现的不是个体的特异性 而是同一种中药群体的相似性，即中药内“共有特征”，能体 现指纹图谱的相似性；指纹图谱的解析不强调图谱的精密计算 和完全相同，而是强调图谱的准确辨认和相似。利用指纹图谱 作为中药质量控制技术，并不要求检测出中药中每一组分的化 学结构，但要求其图谱应具有“指纹”的特征，即要求其具有 专属性。同时，作为中药质量控制的有效方法之一，中药的化 学特征指纹图谱需具有重现性和可操作性。
• 若用硅胶色谱柱应保持流动相PH在3.0~8.0 之间。 • 柱子过夜要冲洗掉盐类和缓冲液，以纯流 动相保存。 • 为了避免漏检样品中可能存在的化合物,建 议用洗脱能力非常强的流动相,做第一次预 实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂 的比例。
确定方法的有效性
• 在精密度、方法可重复性及样品稳定性分 析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰 保留时间的相对标准偏差来确定。 • 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方 法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确 保溶液在规定温度条件下48小时内稳定。
不同检测方法会使分析的精密度、峰型、保留时间和分离度（即分离出的成分多少） 有所不同。
中药的高效液相指纹图谱分析方法
• 中药高效液相指纹图谱分析是以样品间色谱峰图 共有峰的不同峰面积和保留时间为对象进行比对 分析的。分析时大多结合药材，制剂有效成分所 在部位以相应溶剂提取该部位有效成分，而有些 制剂或药材用一种溶剂不能完全获取全部代表性 有效成分时则采用多色谱指纹图谱分析。以不同 溶剂提取获得多个色谱图。
指纹图谱测定实验步骤
• 1.供试品及对照品的制备 • 2色谱条件的选择 • 3.方法学考察
• • • • 线性关系的考察 精密度实验 稳定性试验 重现性试验（保证相对保留时间的RSD<1%,相对保留面 积的RSD<3%） • 加样回收率实验
• 4.指纹图谱的建立和共有指纹图谱峰的指认
样品的溶液制备选择方法
色谱柱的冲洗和预平衡：
• 先用纯溶剂冲洗平衡柱子，再使用自己所选用的 流动相冲柱子。 • 若上次实验中有盐或对离子试剂需要先用含水流 动相（实验用的流动相）冲洗后再用纯溶剂平衡 柱子。防止影响下次实验。 • 常用溶剂： • 酸：醋酸，磷酸，三氟乙酸（用于酸性化合物） • 胺：三乙胺（用于碱性化合物） • 醋酸、三乙胺（复杂化合物）
1.提取方法的选择（冷浸，回流，超声，微波等），需要对 实验图谱比较不同提取液和提取方法对色谱峰的影响来选 择合适的方法,最终还需要对选择的溶液制备方法进行优 化。 2.不同溶剂提取对色谱峰的影响 确定溶剂及提取方法后，观察不同浓度溶剂对色谱峰影响 和峰型影响，在保证提取时所有组分峰出现并稳定的同时 要确保样品溶液与初始流动相的性质尽量保持一致，这样 可保证峰多的同时畸形峰也少。
• 指纹图谱中，各色谱峰所代表的物质的光吸收曲 线不可能相同，而物质含量检测的理想条件是获 得待测物质的光吸收曲线峰值或最大值，因此， 固定单波长下精确的检测色谱峰所代表的多种物 质含量是不可能的。 • 如果可以获得指纹图谱中个色谱峰的代表物质光 吸收峰值，就可精确测定这些物质的含量，而二 极管阵列检测器的应用使同时精确测定的多种物 质的含量成为可能。
指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 4. 可追踪制剂中某些化学成分的变化，可利用指 纹图谱考察中药中某些成分的稳定性。 • 5. 可检测原料与成品之间及成品的批次间质量稳 定性。可规范生产工艺保证产品稳定性（对中间 体或半成品进行指纹图谱）。 • 指纹图谱技术利用中药特征指纹图谱的差异实现 中药真伪鉴别；而利用中药特征指纹图谱主要特 征峰的含量或比例实现中药质量的有效控制。