UPLC(超高效液相色谱)技术

UPLC（超高效液相色谱）技术

蒋娴丽 3031901045

在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的“精度”。当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。针对这样的观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。

站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS及MS/MS 等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。简而言之，我们需要“更快地得到更好的结果”。

今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然。简而言之，UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。

理论基础

早在1956年，J.J van Deemter就发表了他著名的理论：van Deemter曲线及其方程式。最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来出现的液相色谱上也能应用这个理论。Waters 公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。

首先探讨一下这个著名的方程式。如果只关心理论塔板高度（H）与流速（线速度；u）及填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化：

H=a(dp)+b/u+c(dp)²u

其中，A项代表了颗粒度和柱床填装的优良程度；B项代表了轴向扩散；而C项则代表了传质。从不同颗粒度的曲线中我们可以看到图1所示的现象：

首先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。

因此，要真正创建一个全新的分离科学领域－UPLC，必须解决以下问题：

1、大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。

2、高压溶剂输送单元（超过15000psi）。

3、完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问题。

4、快速自动进样器，降低进样的交叉污染。

5、高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题。

6、系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。

新型色谱填料及装填技术

UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7祄颗粒填料合成出来之后才有可能。色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括耐高压、耐酸碱等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证即堵住颗粒不使其外流，又不至于引起反压的大幅升高。

Waters公司利用1999年发明的杂化颗粒技术（Hybrid Particle Technology － HPT），合成了第二代有机硅填料。它使用双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团（图2）。这样合成出来的填料在其内部有了更多的“交联”结构，其机械强度有了极为显著的提高，

耐压超过了20000psi。使用这项技术，Waters公司合成了低于2祄颗粒度的填料—— 1.7祄颗粒度的“ACQUITY UPLCTM”填料。为了得到更好的耐压能力及传质作用，还优化了该填料的孔体积及孔径。

传统色谱柱填料的装填技术受两个方面的影响，导致现有小颗粒填料色谱柱的性能及质量均不能令人满意。首先是其颗粒度分布一般较宽，例如，5祄颗粒度填料中会有大量的4祄以下及6祄以上的颗粒，因此，通常使用2祄筛板在色谱柱的出口拦截填料，阻止其外漏。其次，如果使用低于2祄的筛板，筛板的反压升高很快，甚至超过了填料所产生的反压。因此，目前大多数3.5祄、2.5祄或更低颗粒度的填料还是使用2祄的筛板，只是在柱头装填一小段5祄的填料。因此现有小颗粒度填料的色谱柱与理论或理想状态相距甚远。

Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更严格的筛分技术使1.7祄填料的分布很窄，并且使用了全新筛板（专利申请中）及其他色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过20000psi 的压力下装填。Waters公司为此安装了一条新的色谱柱装填生产线及新的测试设备。因此，ACQUITY UPLCTM色谱柱的性能及质量有了质的飞跃。

填料的合成技术、颗粒的筛分技术、筛板及色谱柱硬件技术的提高，在更高的压力下装填色谱柱是UPLC色谱柱性能、质量保证的关键。

超高压液相色谱泵

Waters公司具备制造超高压泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高压液相色谱泵是Waters公司为其特别制造的。除了密封、高压动力之外，超高压色谱泵主要解决的问题是超高压下溶剂的压缩性及绝热升温（Adiabatic Heating）。

ACQUITY UPLCTM装备一台独立柱塞驱动、四个溶剂切换的两元高压梯度泵，其1ml/min 流速时的耐压可达15000psi，具有精确、可靠的梯度性能。新型的超高压输液泵使独特的

小颗粒填料技术可以在最优化的流速下工作，以充分发挥其特点。集成改进的真空脱气技术，使四个流动相溶剂及两个进样器洗针溶剂同时得到良好的脱气。其梯度的重现性也非常好，尽管保留时间在1min以内，其重现性却与HPLC的重现性不相上下。

自动进样器

为了降低死体积、减少交叉污染，自动进样器的设计使用了许多新技术，例如针内针样品探头（XYZZ’）、压力辅助进样等等。所谓“针内针”的XYZZ’设计，实际上就是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而“外针”是一小段硬管，用来扎破样品瓶盖。

压力辅助进样在如此小的仪器的系统体积下保证可靠、重现的进样是非常重要的措施。为了降低交叉污染，采用了一强、一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两个洗针溶剂也采取了脱气措施。

高速检测器

然而，在新的色谱柱技术支持下的高压、高速UPLC对ACQUITY UPLCTM结果的检测提出了挑战。首先是速度问题，在短时间内出现如此多的色谱峰需要更快的数据采集速率相适应，至少要在10Hz以上，还需要降低样品在检测池内的驻留时间。当然同普通的HPLC检测器一样，信噪比也是新型检测器的追求目标。

尽管因需要降低扩散而不得不使用很小体积的检测池（<1礚），但是仍然要设法提高光能量通过及传输来降低噪音。同时必须使用更快的采样速率、非常小的时间常数值，以适应UPLC所产生的非常窄的色谱峰。ACQUITY UPLCTM使用新型光纤引导、Teflon AF池壁的流动池；10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通过光纤完全引入流动池后，利用Teflon AF的特征在池壁内全折射，不损失光能量；同时采样速率达到40点/s。

这样设计的高速检测器不但适应了UPLC高速及高分辨率的特征，而且还对UPLC灵敏度的提高有很大的帮助。

检测池体积小、低扩散不至于降低柱效。