03 目的基因的获得解析
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记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNA重组过程，需要各种工具酶 的参与）
3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物
2
第5章 目的基因的获得
contents
基因组DNA的处理： • 用两种酶对基因组进行部分酶切； • EcoRI甲基化酶封闭EcoRI位点； • EcoRI连杆(linker)与平末端连接； • EcoRI酶切产生粘性末端； Λ 噬菌体置换型载体的处理： • Cos位点退火，载体成环； • 用EcoRI酶切产生1个大片段，2个小 片段； • 去掉小片段，保留大片段； 连接反应： • 大片段与基因组片段连接形成噬菌 体基因组的串联体； • 在cos位点酶切成噬菌体大小后包装 进噬菌体头部； 20 20 • 感染宿主并在宿主中增殖。
核酸电泳装置—电泳槽、倒胶板
第3章 目的基因的获得
耗材
第3章 目的基因的获得
大肠杆菌总DNA的提取
1. Pellet 0.1 g or 2mL菌液，+ TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 450μL + 10 % SDS 45μL + 10 mg/mL PK 6μL 2. 37℃温浴 1 h (至清澈透明) 3. 酚/仿 抽提 3 次 (至无蛋白层) 4. 上清 + 1/10的3 M NaAc, + 等体积异丙醇
the entire starting population
某种生物的基因组的全部遗传信息切割成一定长度的DNA片段，再
通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个集合即为该生物 的基因组文库
构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组
织器官特异性； 一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码 区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文 库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列， 所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。
第3章 目的基因的获得
•A convenient simplification can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently, such as Sau3AI. • Sau3AI and BamHI create the same cohesive ends.
（2）载体分别与得到的基因组DNA大 片段进行连接 直接连接、人工接头（adapter）或同聚物加尾。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。 （3）重组载体各自转导受体细胞，扩 大培养，得到基因组文库 Q：什么是adapter？ Linker？同尾酶？（第2、 5章）
（4）筛选重组子
将连杆先连接到待连接的一种或两种DNA片段 的末端，然后用合适的限制酶切割连杆，使待连 接的两种DNA片段产生互补粘性末端，最后DNA连 接酶催化，产生重组DNA分子。
第5章 目的基因的获得
衔接头 adaptor
• 一种化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制 酶识别序列。其与连杆的重要差别是衔接头的一 端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产 生的粘性末端。
第三章 目的基因的获得
*
第5章 目的基因的获得
basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤
1.目的基因的获得：从复杂的生物基因组中，经过PCR扩增或基因组文库筛
选、cDNA文库筛选等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标
5. 75 %酒精洗涤沉淀2-3次
6.干燥，TAE溶解
第3章 目的基因的获得
第5章 目的基因的获得
3.2 从基因文库中筛选目的基因
• 基因组文库的构建
• cDNA文库的构建
第5章 目的基因的获得
构建基因组文库筛选目的基因
• Genomic libraries ：a collection of clones, representative of
第5章 目的基因的获得
基因组文库的大小
• 一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有 DNA序列 • 理论上的克隆子数目＝基因组DNA总长度/DNA插入 片段的平均长度
• 实际的克隆子数目：大于理论
载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重 组子的数目。载体容量越大，构建文库所要求的DNA片段数目越少，所需 的重组子越少。
12 12
第5章 目的基因的获得
13 13
*
①
第5章 目的基因的获得
Process constructing a genemic library （基因组文库的构建流程）
靶DNA未测序或未定位时，可通过基因组文库筛选靶DNA。
（1）染色体DNA大片段的制备
物理切割法：超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片段。
14 14
形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库
第5章 目的基因的获得
• 自学
第5章 目的基因的获得
• 引物 primer
• 连杆 linker
• 衔接头 adaptor
第5章 目的基因的获得
连杆 Linker
一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片断。 一般由8－12个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补 对称。 其上有一种或几种限制性内切酶识别序列。
第5章 目的基因的获得
•Sau3AI和BamHI是 同尾酶。
采用λ噬菌体载体进 行基因组文库的构建 19 19 示意图
第3章 目的基因的获得
Producing representative genomic libraries in λ cloning vectors (1978年，最早用两种不 常见的酶酶切基因组，进行克隆。 )
从基因组 DNA获得
从文库 （基因组 文库和 cDNA文库） 获得
化学合成
聚合酶链 式式反应 (PCR)法
Hale Waihona Puke Baidu5章 目的基因的获得
3.1 从基因组DNA获得目的基因
• 碱抽提法提取总DNA • 层析法获得细胞总RNA • 核酸的定量和纯度测定
第3章 目的基因的获得
核酸电泳装置—电泳仪
第3章 目的基因的获得
3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物
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第5章 目的基因的获得
contents
基因组DNA的处理： • 用两种酶对基因组进行部分酶切； • EcoRI甲基化酶封闭EcoRI位点； • EcoRI连杆(linker)与平末端连接； • EcoRI酶切产生粘性末端； Λ 噬菌体置换型载体的处理： • Cos位点退火，载体成环； • 用EcoRI酶切产生1个大片段，2个小 片段； • 去掉小片段，保留大片段； 连接反应： • 大片段与基因组片段连接形成噬菌 体基因组的串联体； • 在cos位点酶切成噬菌体大小后包装 进噬菌体头部； 20 20 • 感染宿主并在宿主中增殖。
核酸电泳装置—电泳槽、倒胶板
第3章 目的基因的获得
耗材
第3章 目的基因的获得
大肠杆菌总DNA的提取
1. Pellet 0.1 g or 2mL菌液，+ TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 450μL + 10 % SDS 45μL + 10 mg/mL PK 6μL 2. 37℃温浴 1 h (至清澈透明) 3. 酚/仿 抽提 3 次 (至无蛋白层) 4. 上清 + 1/10的3 M NaAc, + 等体积异丙醇
the entire starting population
某种生物的基因组的全部遗传信息切割成一定长度的DNA片段，再
通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个集合即为该生物 的基因组文库
构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组
织器官特异性； 一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码 区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文 库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列， 所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。
第3章 目的基因的获得
•A convenient simplification can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently, such as Sau3AI. • Sau3AI and BamHI create the same cohesive ends.
（2）载体分别与得到的基因组DNA大 片段进行连接 直接连接、人工接头（adapter）或同聚物加尾。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。 （3）重组载体各自转导受体细胞，扩 大培养，得到基因组文库 Q：什么是adapter？ Linker？同尾酶？（第2、 5章）
（4）筛选重组子
将连杆先连接到待连接的一种或两种DNA片段 的末端，然后用合适的限制酶切割连杆，使待连 接的两种DNA片段产生互补粘性末端，最后DNA连 接酶催化，产生重组DNA分子。
第5章 目的基因的获得
衔接头 adaptor
• 一种化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制 酶识别序列。其与连杆的重要差别是衔接头的一 端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产 生的粘性末端。
第三章 目的基因的获得
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第5章 目的基因的获得
basic process of DNA recombination in vitro 体外DNA重组的基本步骤
1.目的基因的获得：从复杂的生物基因组中，经过PCR扩增或基因组文库筛
选、cDNA文库筛选等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标
5. 75 %酒精洗涤沉淀2-3次
6.干燥，TAE溶解
第3章 目的基因的获得
第5章 目的基因的获得
3.2 从基因文库中筛选目的基因
• 基因组文库的构建
• cDNA文库的构建
第5章 目的基因的获得
构建基因组文库筛选目的基因
• Genomic libraries ：a collection of clones, representative of
第5章 目的基因的获得
基因组文库的大小
• 一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有 DNA序列 • 理论上的克隆子数目＝基因组DNA总长度/DNA插入 片段的平均长度
• 实际的克隆子数目：大于理论
载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重 组子的数目。载体容量越大，构建文库所要求的DNA片段数目越少，所需 的重组子越少。
12 12
第5章 目的基因的获得
13 13
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①
第5章 目的基因的获得
Process constructing a genemic library （基因组文库的构建流程）
靶DNA未测序或未定位时，可通过基因组文库筛选靶DNA。
（1）染色体DNA大片段的制备
物理切割法：超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片段。
14 14
形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库
第5章 目的基因的获得
• 自学
第5章 目的基因的获得
• 引物 primer
• 连杆 linker
• 衔接头 adaptor
第5章 目的基因的获得
连杆 Linker
一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片断。 一般由8－12个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补 对称。 其上有一种或几种限制性内切酶识别序列。
第5章 目的基因的获得
•Sau3AI和BamHI是 同尾酶。
采用λ噬菌体载体进 行基因组文库的构建 19 19 示意图
第3章 目的基因的获得
Producing representative genomic libraries in λ cloning vectors (1978年，最早用两种不 常见的酶酶切基因组，进行克隆。 )
从基因组 DNA获得
从文库 （基因组 文库和 cDNA文库） 获得
化学合成
聚合酶链 式式反应 (PCR)法
Hale Waihona Puke Baidu5章 目的基因的获得
3.1 从基因组DNA获得目的基因
• 碱抽提法提取总DNA • 层析法获得细胞总RNA • 核酸的定量和纯度测定
第3章 目的基因的获得
核酸电泳装置—电泳仪
第3章 目的基因的获得